Name: الحصول على A مع 3Cs: التقاط تشوه الكروموسوم للطلاب الجامعيين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: تعلم تقنية التقاط تشكيل الكروموسوم 3C لدراسة تنظيم الكروماتين وتأثيره على التعبير الجيني باستخدام C. elegans. يوفر هذا البروتوكول تجربة بحثية عملية للطلاب الجامعيين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل شبكة جائزة رود آيلاند للتطوير المؤسسي (IDeA) للتميز في البحوث الطبية الحيوية من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم P20GM103430 ومركز براينت للصحة والعلوم السلوكية.

التقاط شكل الكروموسوم (3C) للبحث والتدريس الجامعي

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

3C هي تقنية قوية متجذرة في التقنيات الجزيئية الأساسية. هذا هو أساس الأدوات الأساسية التي تجعل 3C تقنية مثيرة للاهتمام لاستخدامها مع الطلاب الجامعيين. مع وجود العديد من الدراسات الحديثة التي تراقب ديناميكيات الكروماتين على هذا النطاق الواسع ، فإن استخدام هذه النتائج لابتكار تجربة ضيقة التركيز على جين واحد أو منطقة جينومية واحدة لديه القدرة على إنشاء تجربة فريدة ومؤثرة في الأبحاث الجامعية. في كثير من الأحيان ، تعتبر مثل هذه التجارب متقدمة جدا بالنسبة للطلاب الجامعيين ، ولكن مع التخطيط الدقيق ، يمكن تحقيقها بسهولة. من المهم ملاحظة أن المقايسات المصممة لفحص اتصالات الكروماتين التي تم التقاطها بواسطة مكتبة 3C يمكن أن تختلف من تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي لنقطة النهاية إلى تسلسل الجينوم الكامل. في الواقع ، تم إنشاء بيانات من أول ورقة 3C16 من qPCR. يمكن استخدام هذه المجموعة الواسعة من المقايسات لأن جميع تقنيات 3C تنتج نفس المنتج - مكتبة من شظايا الحمض النووي التي تمثل اتصالات ثلاثية الأبعاد في النواة.
يظهر هنا تكييف لبروتوكول أكثر مرونة واستيعابا يناسب الباحثين الجامعيين بشكل أفضل. فترات التوقف المذكورة أعلاه تعني تأخيرات بين عشية وضحاها. ومع ذلك ، يمكن أن تمتد هذه التوقفات خلال عطلات نهاية الأسبوع ، وفي حالة الخلايا والنوى ، لأسابيع. الاعتبار الأكثر أهمية هو متى سيتم إنجاز العمل. في كثير من الأحيان في البروتوكولات ، هناك خطوات حساسة للوقت عندما لا يكون الإيقاف المؤقت خيارا. خارج بضع نقاط (اليوم 1 واليوم 2) ، هناك العديد من الأماكن لإيقاف العينة وتجميدها. هذه أمر بالغ الأهمية عند العمل مع الطلاب الجامعيين حيث يجب أن تكون جداول وتوقيت العمل المخبري مرنة. بالإضافة إلى هندسة هذه التوقفات في البروتوكول ، يتم تشجيع الطلاب الجامعيين على العمل في أزواج أو حتى مجموعات صغيرة من ثلاثة أو أربعة. تعمل المجموعات بشكل جيد لهذا البروتوكول ، حيث يمكن للطلاب دعم بعضهم البعض وإنشاء نظام أصدقاء حتى يعمل الجميع بأمان. العمل في المختبر هو أيضا أكثر متعة مع الآخرين المعنيين. مع المجموعات ، يمكن للطلاب أيضا العمل على مجموعة متنوعة من الأسئلة التي تركز على تنظيم الكروماتين مع الاستمرار في تنفيذ نفس البروتوكول. وبالتالي ، حتى أثناء عمل الطلاب في مشاريع منفصلة ، يربط البروتوكول جهودهم ، ولهذا السبب ، يمكنهم دعم بعضهم البعض.
تهدف التعديلات الأخرى إلى التغلب على حقيقة أن بعض الأدوات والمعدات المتخصصة لا توجد بالضرورة في جميع المؤسسات الجامعية. تشمل هذه القطع من المعدات على سبيل المثال لا الحصر أجهزة التدوير الحراري qPCR وأنظمة توثيق الهلام ومطياف حجم النانو. في الواقع ، هذه القطع من المعدات مريحة ولكنها ليست شرطا. هنا ، يتم وصف الطريقة الكلاسيكية ل 3C أيضا في جزء التصميم التمهيدي ؛ يتضمن ذلك تحديد موضع الاهتمام الجينومي ، ومن ثم تقييم المواقع الجينومية الأخرى لنقاط اتصال الكروماتين البعيدة. تعمل هذه التقنية أيضا بشكل جيد إذا تم استخدام مجموعة بيانات منشورة ، مثل مجموعة بيانات تستخدم Hi-C ، حيث يتم تحديد المواقع الإيجابية (المتصلة) والسالبة (غير المتصلة) المعروفة. يعد تصميم التجارب باستخدام مجموعات البيانات المنشورة هذه تكيفا رائعا آخر لمختبرات التدريس ، حيث أن فرصة التعرف الناجح على اتصالات الكروماتين عادة ما تكون أكبر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مناقشة المقالة البحثية في الفصل واستخدامها كمرجع.
يستخدم هذا البروتوكول نهج qPCR المعدل لتصور تكوين منتج 3C. الضوابط ضرورية لنجاح تقنية 3C. تستخدم كل تجربة كلا من عناصر التحكم في العينة وعناصر التحكم التمهيدية لتحديد اكتمال إجراء 3C. تتضمن عناصر التحكم في العينة عنصر تحكم غير مهضوم (الحمض النووي الجينومي) والتحكم المهضوم. يحدد التحكم غير المهضوم إشارة خط الأساس لمجموعات التمهيدي ويستخدم مع التحكم في الهضم المتقاطع لتحديد كفاءة الهضم من المتوقع أن يكون هناك انخفاض في المنتج لأي بادئات موجهة عبر موقع التقييد. توفر مقارنة هذه القيمة بعنصر التحكم غير المهضوم مؤشرا على مدى جودة هضم العينة.
تشتمل البادئات الخاصة ب PCR على برايمر تحكم وبرايمر اختبار. التمهيدي للتحكم عبارة عن مجموعة أولية تقع بالقرب من المنطقة الجينومية التي يتم فحصها ولا تحتوي على موقع تقييد. يوفر هذا خط الأساس لتحديد وفرة منتجات اختبار PCR التمهيدي. بادئات الاختبار عبارة عن بادئات أمامية وخلفية تحيط بموقع تقييد لموضع اهتمام جينومي معين (الشكل 3). تتم مقارنة التفاعلات باستخدام مجموعات التمهيدي هذه لتحديد كفاءة الهضم ، حيث يجب أن تنخفض وفرة المنتج إذا تم قطع موقع التقييد. عند تحديد تنظيم الكروماتين ، يتم إقران اختبار تمهيدي واحد من موضع واحد مع اختبار تمهيدي آخر من موضع جينومي مختلف لتحديد ما إذا كان هذان الموقعان قريبان من بعضهما البعض في مساحة 3D. في هذه الحالة ، من المتوقع أن يتم العثور على منتج PCR فقط باستخدام عينة 3C كنموذج.
من المهم ملاحظة أنه حتى البادئات التي تم التحقق من صحتها تميل إلى الفشل (الشكل 4: مجموعة التمهيدي r14). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل متكرر في تفاعلات التحكم وفي التفاعلات التي لا يتم فيها التنبؤ باتصال الكروماتين (مثل التحكم المهضوم ، لأنه غير مرتبط). يتم تسلسل هذه الحالات وإما تفشل Sanger QC أو تعود بدون تسلسل محدد (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، تولد تجارب 3C التقليدية "قالب تحكم" ، وهو عينة من الحمض النووي غير مترابطة ومهضومة ومربوطة ، والتي تمثل جميع الأجزاء المربوطة المحتملة التي يمكن إنتاجها بكمية معينة من الحمض النووي. يلعب "قالب التحكم" دورا مهما في مقارنة شدة إشارات qPCR بين موقعين جينوميين لتحديد ما إذا كانت الإشارة تمثل تفاعلا حقيقيا أم مجرد ارتباط عشوائي. قد يكون إنشاء "قالب تحكم" مشكلة ، حيث يجب التقاط جزء كبير من الكروماتين الذي يتم فحصه في شكل كروموسوم اصطناعي ومعالجته مع عينات 3C. قد لا يكون تأمين مثل هذا البناء ممكنا ، وقد يكون إنشاء واحد خارج نطاق مشروع الفصل الدراسي. بسبب هذه الصعوبات ، نقترح استخدام التمهيدي التحكم. لا يحل التمهيدي للتحكم محل جميع وظائف "قالب التحكم" ولكنه لا يزال يوفر الفرصة لتحليل البيانات لاتخاذ قرارات "الحضور" أو "الغياب".
عند إجراء qPCR ، من المهم استخدام كميات متساوية من العينة. يجب تحديد ذلك ، حتى لو كان يستخدم مقياس الطيف الضوئي النانوي مثل nanodrop ، عن طريق توليد منحنى قياسي من الحمض النووي الجينومي بتركيز معروف وتركيب عينات 3C على هذا الخط. يجب تسجيل هذه المبالغ واستخدامها في PCRs اللاحقة. جودة تفاعل PCR مهمة أيضا. نظرا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل يعمل في qPCR ، يتم قياس وفرة المنتج باستخدام مضان وتسجيله. يمكن الوصول إلى هذا التسجيل في مخطط التضخيم. بمجرد انتهاء البرنامج ، من المهم التحقق من مخطط التضخيم والتأكد من أن التفاعلات (باستثناء عناصر التحكم في عدم وجود قالب) لها ثلاث مراحل: خط الأساس ، والأسي ، ومرحلة الهضبة / التشبع. من المهم التحقق من أن ردود الفعل لها مرحلة أسية ، خاصة لتحديد العتبة (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للعينات المخففة بشكل متسلسل ، يجب أن يكون هناك تحول في قيم Ct بما يتفق مع تخفيف العينة (سيكون لأعلى تركيز أدنى قيم Ct ، بينما سيكون للتركيز الأدنى أعلى قيم Ct). تتطلب العينات التي لا تعكس هذا التغيير في مخطط التضخيم تخفيفا جديدا أو تشير إلى مشكلة أكبر في تكوين عينة 3C. أخيرا ، أثناء إنشاء المنحنى القياسي ، سيحسب برنامج PCR كفاءة PCR وقيمة R2 . يجب أن تكون كفاءة PCR أكبر من 90٪ ، ويجب أن تكون قيمة R2 أكبر من 0.99. إذا لم يتم استيفاء أي من هذه الشروط ، فمن المحتمل أن يكون هناك خطأ ما في العينة أو بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد qPCR ، يمكن حساب النسبة المئوية للهضم ووجود تفاعلات 3C باستخدام qPCR Ct لكل تفاعل. لتحديد هذه ، أولا ، يجب تعيين عتبة تفاعل PCR. يتم ذلك عادة باستخدام البرنامج الذي يأتي مع جهاز qPCR. سيحدد تحديد العتبة تركيز منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي سيتم استخدامه لمقارنة قيم عينة Ct. يجب أن تقسم العتبة منحنيات التضخيم لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في المرحلة الأسية للتضخيم. يمكن مقارنة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل فقط مع التضخيم الأسي (في هذه الحالة ، بادئات التحكم وتفاعلات الاختبار التمهيدي) ، لأن هذه هي الطريقة الوحيدة للتأكد من أن التفاعلات تضخم الحمض النووي بنفس المعدل ويمكن مقارنتها بأمانة. عند تحليل الرسوم البيانية 3C ، يتم تحديد التفاعلات الإيجابية المشروطة على أنها تلك التي تحتوي على المزيد من المنتج على عينات التحكم ، والتحكم الجيني ، والتحكم في الهضم (الشكل 4B). ومع ذلك ، يجب التحقق من صحة هذه العينات باستخدام تسلسل سانجر بعد تنقية الهلام لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد تسلسل سانجر ، يمكن تحليل العينات التي تجتاز مراقبة الجودة باستخدام Blat. الهدف من هذا التحليل هو تحديد ما إذا كانت العينة تحتوي على تسلسل كل من المواقع الجينومية المستهدفة المحيطة بموقع التقييد (DpnII في حالة هذا البروتوكول). إذا تم تحديد كلا التسلسلين ، فيمكن اعتبار جزء 3C مصدقا عليه. إذا لم ترجع نتائج Blat التسلسل المتوقع ، فقد يشير ذلك إلى أن أحد البادئات أو كليهما ليس هو الأمثل ، مما يؤدي إلى نتيجة qPCR إيجابية خاطئة. ستحتوي ملفات التتبع للعينات الإيجابية الخاطئة على قمم أساسية غير محددة ، وستحتوي تقارير Seq في الغالب على استدعاءات أساسية "n".
يعد التحقق من صحة سانجر أمرا ضروريا ، حيث يمكن الحصول على إيجابيات خاطئة من تكوين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الأثري. يمكن تحديد هذه الإيجابيات الخاطئة عندما لا تحتوي منتجات التسلسل على التسلسل المستهدف المتوقع أو خاصية موقع DpnII لجزء 3C مناسب (الشكل 5). يوفر تسلسل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضا نقطة بيانات أخرى للتجربة ويدفع الطلاب إلى أن تقنية 3C تحدد المواقع الجينومية البعيدة التي تتجمع في الفضاء ثلاثي الأبعاد داخل النوى.
توفر تقنية 3C ثروة من التقنيات الجزيئية الأساسية للطلاب الجامعيين في إجراء مرن ومباشر. تعد تقنية 3C هذه أيضا نقطة انطلاق لتقنيات 3C الأخرى التي تتضمن تسلسل الجيل التالي (NGS). هذه الأنواع من التجارب يمكن أن تعرض الطلاب الجامعيين لجوانب مهمة من المعلوماتية الحيوية وهي متجذرة في المبادئ الأساسية الموضحة هنا. الخبرة الجامعية والمشاركة هي مفتاح نجاحهم وتطورهم كعلماء شباب. من خلال توفير هذه الفرص ، يمكن للطلاب الجامعيين تعزيز فهمهم للمبادئ الأساسية مع بناء ثقتهم في معالجة التقنيات والأسئلة المتطورة.

لا يحتوي جينوم الكائن الحي على جميع الجينات اللازمة للوظيفة فحسب ، بل يحتوي أيضا على جميع التعليمات حول كيفية ووقت استخدامها. هذا يجعل تنظيم الوصول إلى الجينوم أحد أهم وظائف الخلية. هناك العديد من الآليات للتحكم في وظيفة الجينات. ومع ذلك ، في مستواه الأساسي ، يعود تنظيم الجينات إلى قدرة عوامل النسخ التنظيمية (العوامل العابرة) على الارتباط بتسلسلات الحمض النووي المحددة (تسلسلات رابطة الدول المستقلة التنظيمية). هذه ليست قدرة فطرية. بدلا من ذلك ، يحكمها تنظيم / هيكل الجينوم في النواة ، والذي يتحكم في توافر / تعرض التسلسلات التنظيمية لرابطة الدول المستقلة للعواملالعابرة 1،2،3. إذا لم تتمكن العوامل العابرة من العثور على تسلسلاتها التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، فلن تتمكن العوامل العابرة من أداء مهامها التنظيمية. وقد جعل هذا فهم كيفية تنظيم الجينوم في النواة مصدرا مهما للبحث.
من المقبول على نطاق واسع أنه خلال الطور البيني ، تحتل الكروموسومات حقيقية النواة في النواة مجالها الخاص المرتبط بالصفيحة النووية والمصفوفة النووية (الشكل 1) ، مما يجعل الكروموسوم أشبه بشريحة من البيتزا ، بدلا من المعكرونة على طبق من السباغيتي. تتكثف الكروموسومات جزئيا عن طريق تفاعلات البروتين والحمض النووي (الكروماتين) التي تلتف وتدور أجزاء من الكروموسوم. من خلال المجهر الإلكتروني ، ومضان الحمض النووي ثلاثي الأبعاد في التهجين الموضعي (FISH) ، وتقنيات وضع علامات الحمض النووي (أي مثيلة الحمض النووي الفلورية والاصطناعية) ، تم العثور على مجالات غير نشطة من الكروماتين معبأة بإحكام على طول المحيط النووي4،5،6 ، بينما توجد أجزاء من الكروماتين النشط الأقل كثافة في داخل النواة7،8،9 ، 10. توفر هذه التجارب رؤية واسعة الزاوية لديناميكيات الكروموسومات ولكنها لا تفعل الكثير لالتقاط التغييرات التي تحدث محليا حول المحفزات الجينية التي لوحظت في دراسات DNase11,12 و nucleosome13,14,15.
كان المفتاح لفتح ديناميكيات الكروماتين عالية الدقة هو صياغة تقنية رسم خرائط الكروموسوم ثلاثي الأبعاد ، 3C. تتكون تقنية 3C نفسها من أربع خطوات رئيسية: تشابك الكروماتين ، وهضم الكروماتين عن طريق إنزيمات التقييد ، وربط الكروماتين ، وتنقية الحمض النووي (الشكل 2). يمكن بعد ذلك توصيف شظايا الحمض النووي الاصطناعي الجديدة الناتجة عن هذه العملية للكشف عن الارتباط الفيزيائي الوثيق بين القطع البعيدة خطيا من الحمض النووي16. أصبحت تقنية 3C الأساس لإنشاء تقنيات عرضية متعددة تستخدم الخطوات الأولية ل 3C لطرح أسئلة أوسع على مستوى الجينوم (على سبيل المثال ، Hi-C ، 4C ، ChIP-C). حددت هذه العائلة من تقنيات 3C أن الكروموسومات يتم تنظيمها في وحدات منفصلة متعددة تسمى المجالات المرتبطة طوبولوجيا (TADs). يتم ترميز TADs في الجينوم ويتم تعريفها بواسطة حلقات الكروماتين المحاطة بحدود غير حلقية16،17،18،19. يتم الحفاظ على حدود TAD من خلال عاملين محفوظين تطوريا ومنتشرين في كل مكان ، بما في ذلك عامل ربط CCCT (CTCF) والتماسك ، مما يمنع الحلقات داخل TADs المنفصلة من التفاعل16،20. يتم التوسط في الحلقات من خلال تفاعل العوامل العابرة مع تسلسلاتها التنظيمية ، وكذلك CTCF والتماسك21.
على الرغم من أن العديد من الدراسات التي تستخدم تقنيات 3C تطرح أسئلة واسعة على مستوى الجينوم وتستخدم تقنيات معقدة لجمع العينات ، فإن صياغة تقنية 3C تعتمد على تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية. هذا يجعل 3C مثيرة للاهتمام للنشر في كل من مختبرات البحث والتدريس الجامعية. يمكن استخدام تقنية 3C للأسئلة الأصغر تركيزا وهي مرنة بطبيعتها للتوسع أو التقليل (الجينات المفردة22 والكروموسومات16 و / أو الجينوم18) اعتمادا على تركيز واتجاه الأسئلة المطروحة. تم تطبيق هذه التقنية أيضا على مجموعة واسعة من الأنظمة النموذجية7،16،19،23 وقد ثبت أنها متعددة الاستخدامات في استخدامها. هذا يجعل 3C تقنية ممتازة للطلاب الجامعيين حيث يمكن للطلاب اكتساب الخبرة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية الشائعة مع اكتساب خبرة قيمة في الإجابة على الأسئلة الموجهة.
يظهر هنا بروتوكول مكيف لإعداد مكتبة 3C بناء على البروتوكولات المنشورة مسبقا24،25،26،27. تم تحسين هذا البروتوكول لحوالي 1 × 107 خلايا ، على الرغم من أنه أنشأ مكتبات 3C مع أقل من 1 × 105 خلايا. أثبت هذا البروتوكول أنه متعدد الاستخدامات وقد تم استخدامه لإنشاء مكتبات 3C من أجنة الزرد وخطوط خلايا الزرد والشباب البالغين (YA) Caenorhabditis elegans (الدودة المستديرة). يجب أن يكون البروتوكول مناسبا أيضا لخطوط خلايا الثدييات ، ومع مزيد من التكيف ، الخميرة.
الهدف من هذه التعديلات هو جعل 3C في متناول الطلاب الجامعيين. تم الحرص على استخدام تقنيات مشابهة لتلك التي يمكن تحقيقها في مختبر التدريس الجامعي. توفر تقنية 3C العديد من فرص التعلم للطلاب الجامعيين لتعلم تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية التي ستفيد تطورهم على مقاعد البدلاء وفي الفصل الدراسي وفي مساعيهم بعد التخرج.

<table><tbody><tr><td>37٪ الفورمالديهايد&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100٪ إيثانول</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td>MP <td>215350280</td><td></td> <td>الطب الحيوي</td></tr><tr><td>الكلوروفورم</td><td>Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete ، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>ممزوج بمقدار 50x في الماء. مخفف إلى 1x في المخزن المؤقت للسكروز و GB المخزن</td></tr> المؤقت <tr><td>الطازج Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>1 M مخزون مخفف إلى 500 & micro ؛ M في المخزن المؤقت للسكروز و GB المخزن المؤقت الطازج</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>glycine</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>glycogen</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>ميثيل البيرونين الأخضر&nbsp; &nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc2</td> <td>Thermoscientific</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>الفينول كلوروفورم&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR مزيج جاهز (Phire Taq إلخ)</td> <td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNase A & nbsp ؛</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>ميلابور سيجما</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

الحصول على a مع 3cs: التقاط تشوه الكروموسوم للطلاب الجامعيين

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

التقاط تشكل الكروموسوم (3C) هو أداة قوية أنتجت عائلة من التقنيات المماثلة (على سبيل المثال ، Hi-C و 4C و 5C ، المشار إليها هنا باسم تقنيات 3C) التي توفر معلومات مفصلة عن التنظيم ثلاثي الأبعاد للكروماتين. تم استخدام تقنيات 3C في مجموعة واسعة من الدراسات ، من مراقبة التغيرات في تنظيم الكروماتين في الخلايا السرطانية إلى تحديد جهات الاتصال المحسنة التي تتم مع محفزات الجينات. في حين أن العديد من الدراسات التي تستخدم هذه التقنيات تطرح أسئلة كبيرة على مستوى الجينوم مع أنواع عينات معقدة (أي تحليل خلية واحدة) ، فإن ما يضيع غالبا هو أن تقنيات 3C ترتكز على طرق البيولوجيا الجزيئية الأساسية التي تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات. من خلال معالجة الأسئلة المركزة بإحكام حول تنظيم الكروماتين ، يمكن استخدام هذه التقنية المتطورة لتعزيز تجربة مختبر البحث والتدريس الجامعية. تقدم هذه الورقة بروتوكول 3C وتوفر تعديلات ونقاط تركيز للتنفيذ في المؤسسات الجامعية في المقام الأول في البحث الجامعي وخبرات التدريس.

سينتج هذا الإجراء عينة تجريبية واحدة من 3C وعينتين ضابطتين (غير مهضومة ومهضومة). باستخدام هذه العينات الثلاث ، تم إجراء qPCR. من هذه النتائج ، تم حساب كفاءة الهضم (المعادلة 1) وتسجيلها (الجدول 1). من هذه الحسابات ، تم تحديد أن عينة 3C لديها كفاءة هضم تقارب 88٪ (متوسط الجدول 1) عبر المواقع الجينومية السبعة التي تم اختبارها.
بعد ذلك ، تم اختبار العينات لوجود اتصالات كروماتين طويلة المدى بين المواقع الجينومية المختلفة باستخدام مجموعات من البادئات الخاصة بالمواقع (الجدول 2) و qPCR. باستخدام هذه النتائج ، تم حساب وفرة المنتج بالنسبة لمجموعة التمهيدي للتحكم (المعادلة 2) ورسمها بيانيا للمقارنة (الشكل 4). أشارت هذه البيانات إلى أن 8 من 10 تفاعلات كانت إيجابية مشروطة للتفاعلات بعيدة المدى.
ثم تم تشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الأغاروز. تم تنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقع للإيجابيات الشرطية الثمانية وتفاعل سلبي واحد بالهلام وإرساله لتسلسل سانجر. تظهر نتائج ردود الفعل التمثيلية الإيجابية (السهم الأزرق ، المربع الأزرق) والسالبة (السهم الأحمر ، المربع الأحمر) (الشكل 5).
<img alt="مخطط طي البروتين ؛ يوضح تغييرات الهيكل من الحالات غير المطوية إلى الحالات المطوية مع التعليقات التوضيحية." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> الشكل 1: تركيب الكروموسوم في النواة. تنظيم كروموسوم افتراضي داخل النواة. (أ) غلاف نووي، خطوط سوداء؛ (ب) الصفيحة النووية، البرتقالية؛ (ج) خطوط متغاير اللون مضغوطة؛ د: إيوكروماتين، حلقات فضفاضة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="مخطط تقاطع الكروموسومات. يوضح إعادة التركيب الجيني ، عملية تبادل الكروماتيد." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> الشكل 2: رسم تخطيطي لبروتوكول 3C. يتم تقريب الأجزاء البعيدة من الكروموسومات الخطية (الأزرق والأصفر والوردي) من بعضها البعض داخل النواة من خلال الحلقات التنظيمية. (أ) تتوسط هياكل الحلقة بعوامل النسخ (الدائرة الرمادية والنجمة السوداء)؛ يتم الحفاظ على هذه التفاعلات من خلال التشابك الكيميائي. (ب) تتكسر الحلقات من خلال الهضم الأنزيمي (الخطوط السوداء). (ج) ترتبط قطع الكروماتين البعيدة معا من خلال الأطراف الشائكة الناتجة عن عملية الهضم. د: ينقى الحمض النووي (DNA) من البروتين. ه: يحدد التتابع داخل الأجزاء ويعود إلى الجينوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="مخطط الكروموسوم ، مواقع DpnII ، بيانات RepeatMasker ، رسم الخرائط الجينية ، تحليل التسلسل الجيني." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> الشكل 3: مخطط التمهيدي 3C. تم تصميم البادئات 3C حول مواقع التقييد على مسافات متفاوتة من الموقع الجينومي محل الاهتمام. تمثل الأسهم الوردية مجموعات التمهيدي التجريبية المحيطة بموقع DpnII. يمكن خلط البادئات التجريبية ومطابقتها لتقييم حلقات الكروماتين في المنطقة. تمثل البادئات البرتقالية تحكما سلبيا بدون موقع DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="مخططات شريطية تقارن مستويات الاختبار التمهيدي في عينات gDNA غير المهضومة والمهضومة ، نتائج 3C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> الشكل 4: بيانات qPCR التمثيلية لتجربة 3C. وفرة نسبية لمجموعات اختبار التمهيدي 3C. (أ) رسم بياني للتحكم يوضح الوفرة النسبية للمنتج في عنصر التحكم غير المهضوم (أزرق) ، وعنصر تحكم مهضوم (رمادي) ، وعينة 3C (برتقالي). (ب) تجربة 3C؛ الوفرة النسبية للمنتج من مجموعات من بادئات الاختبار في عنصر التحكم غير المهضوم (الأزرق) ، والتحكم المهضوم (الرمادي) ، وعينة 3C (برتقالي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="الرحلان الكهربائي ونتيجة التسلسل; تحليل جزء الحمض النووي. الهضم الأنزيمي الدراسة الوراثية." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> الشكل 5: تصور منتجات 3C qPCR. أعلى ، هلام مع منتجات نقطة نهاية qPCR مع العينات المشار إليها. في القاع ، ملفات تتبع تسلسل سانجر التمثيلية لردود الفعل المشار إليها. العينة البرتقالية هي مثال على نتيجة إيجابية خاطئة (انظر الشكل 4 ، r38 / 34) ، والعينة الزرقاء هي مثال على إيجابية حقيقية مع موقع DpnII المشار إليه أعلاه التتبع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>موقع</td>
			<td>٪ الهضم</td>
		</tr><tr><td>آر 8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>ر3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>آر 38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>آر 34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>آر 33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>آر 14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>آر 47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: كفاءة الهضم المحسوبة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اسم</td>
			<td colspan="3">تسلسل</td>
			<td>المواقع الجينومية</td>
		</tr><tr><td>r3 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX: 5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCTCTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 دفع أمامي</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>برايمر التحكم FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>التحكم التمهيدي RVS</td>
			<td colspan="3">غاتغتغاكاك</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: الاشعال لتجربة 3C التمثيلية.

هنا ، نقدم تكيفا لتقنية التقاط تشكل الكروموسوم (3C) بالتفصيل مع التركيز على المشاركة الجامعية والتعلم.

الحصول على A مع 3Cs: التقاط تشوه الكروموسوم للطلاب الجامعيين

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

يهدف بحثنا إلى الكشف عن كيفية تحكم تنظيم الكروماتين في التعبير الجيني. ينصب التركيز على تحديد العوامل التي تنظم الكروماتين على مستوى الجينات للتحكم في نشاط الجينات. حاليا ، يتم استخدام تقنيات مشابهة لالتقاط تأكيد الكروموسوم ، أو 3C ، لإحراز تقدم في هذا المجال.لقد دفعتنا الاستثمارات في تقنيات جمع العينات وتسلسلها إلى ما يمكن أن تظهره لنا تقنيات 3C. التحدي التجريبي الأكبر حاليا هو جمع عينات ذات بنية كروماتين موحدة. عدم التجانس في العينات يؤدي إلى نتائج مربكة.في المستقبل ، سنركز على كيفية لعب التغييرات في تنظيم الكروماتين دورا في السرطان.

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

الأسلوب مرحبا - C يتيح تحديد غير منحازة ، الجينوم واسعة من التفاعلات لونين (1). مرحبا - C الأزواج القرب وربط تسلسل موازية على نطاق واسع. ويمكن استخدام البيانات الناتجة لدراسة الهندسة المعمارية الجينومية على مستويات متعددة : النتائج الأولية التي تم تحديدها ميزات مثل الأراضي الصبغي ، وفصل لونين المفتوحة والمغلقة ، وهيكل لونين على نطاق megabase.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome

يصف هذا العمل بروتوكول لتوليد عالية الدقة في الموقع مرحبا-C مكتبات من أحكام نظموا قبل جاستروليشن melanogaster المورفولوجية الأجنة.

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

حلقات الكروماتين تلعب دوراً هاما في تنظيم الجينات؛ ومع ذلك، كانت هناك لا التطورات التكنولوجية التي تسمح بتعديل حلقات الكروماتين انتقائية وعكسها. هنا يصف لنا نظاما قويا للونين حلقة إعادة تنظيم استخدام كريسبر-dCas9 (CLOuD9)، أظهرت بصورة انتقائية وعكسية تعدل التعبير الجيني في استهداف المكاني.

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

تحديد التفاعلات الفيزيائية بين الجينات والعناصر التنظيمية الصعبة ولكن قد تيسرت بفضل أساليب التقاط تكيف كروموسوم. هذا التعديل على البروتوكول ج 4-seq يخفف التحيز PCR بالتقليل من التضخيم المفرط لقوالب بكر ويزيد من مابابيليتي لما يلي: عن طريق إدراج خطوة هضم إنزيم التقييد بإضافة.

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

نبلغ عن تطبيق التقاط توسوم كموئي متبوع بتسلسل عالي الإنتاجية في أجسام جنينية متولدة من خلايا جذعية جنينية. تسمح هذه التقنية بتحديد وكمية الاتصالات بين المحسّنين المفترضين ومناطق المروج لجين معين أثناء تمايز الخلايا الجذعية الجنينية.

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

Hi-C 3.0 هو بروتوكول Hi-C محسن يجمع بين روابط الغلوتارات الفورمالديهايد و disuccinimidyl glutarate مع مزيج من إنزيمات تقييد DpnII و DdeI لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ودقة اكتشاف تفاعل الكروماتين.

التقاط تشكل الكروموسوم عبر مقاييس الطول

يصف هذا البروتوكول طريقة Capture Hi-C المستخدمة لتوصيف تنظيم 3D للمناطق الجينومية المستهدفة ذات الحجم الضخم بدقة عالية ، بما في ذلك حدود المجالات المرتبطة طوبولوجيا (TADs) وتفاعلات الكروماتين طويلة المدى بين عناصر تسلسل الحمض النووي التنظيمية وغيرها.

فك رموز منظمة كروماتين 3D عالية الدقة عبر التقاط Hi-C

هنا نقدم بروتوكول للتحقيق في الحامض النووي الجينوم في الدراسات المريض السريرية واسعة النطاق الفحص باستخدام ميثيل ربط تسلسل الحمض النووي لقطة (MBDCap تسلسل أو مليون برميل يوميا وما يليها) التكنولوجيا وخط أنابيب تحليل المعلومات البيولوجية اللاحقة.

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

يصف لنا طريقة سهلة وسريعة وغير مكلفة نسبيا لتوليد الجينات تعطل العقدية mutans سلالات؛ قد يكون هذا الأسلوب تكييف لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

تعلم تقنية التقاط تشكيل الكروموسوم 3C لدراسة تنظيم الكروماتين وتأثيره على التعبير الجيني باستخدام C. elegans. يوفر هذا البروتوكول تجربة بحثية عملية للطلاب الجامعيين.

الحصول على A مع 3Cs: التقاط تشوه الكروموسوم للطلاب الجامعيين

استكشف المزيد من الفيديوهات