اضطراب جيني عالي الكفاءة في البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA الكهربائية
أغسطس 4, 2023
يصف هذا البروتوكول إجراء تحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA المجمعة في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي.
يدرس مختبرنا التفاعل بين المتفطرة والسل والجهاز المناعي المضيف ، مع التركيز على التفاعل الأولي بين البكتيريا والبلاعم. هناك مجموعة متنوعة من تقنيات تعطيل الجينات المستخدمة في البلاعم ، بما في ذلك تقنيات RNAi وتقنيات CRISPR. أحد التحديات الرئيسية هو انخفاض كفاءة اضطراب الجينات في البلاعم.
يتيح هذا البروتوكول المعالجة الجينية السريعة وعالية الكفاءة للبلاعم الأولية دون الحاجة إلى الاستنساخ وبناء البلازميد. يجب أن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق على نطاق واسع في علم المناعة ، مما يمكن الباحثين من تعطيل الجينات في الضامة الأولية لمجموعة واسعة من الدراسات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لتحرير الجينوم في الخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم للفئران باستخدام معقدات البروتين النووي الريبوزي Cas9-sgRNA. ويعزز هذا النهج كفاءة التلاعب الجيني في الخلايا البلعمية الأولية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم المناعة
- الهندسة الوراثية
- بيولوجيا الخلايا البلعمية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا البلعمية دوراً حاسماً في الاستجابة المناعية.
- تعد تقنيات تعطيل الجينات ضرورية لدراسة وظائف الخلايا البلعمية.
- غالباً ما تعاني الطرق التقليدية من انخفاض الكفاءة.
- يعالج هذا البروتوكول هذه التحديات من خلال تمكين التلاعب الجيني عالي الكفاءة.
الغرض من الدراسة
- لتحسين كفاءة تعطيل الجينات في الخلايا البلعمية الأولية.
- لتسهيل التلاعب الجيني السريع دون الحاجة إلى الاستنساخ.
- لتوفير طريقة قابلة للتطبيق في مختلف الدراسات المناعية.
الطرق المستخدمة
- تجميع معقدات البروتين النووي الريبوزي Cas9-sgRNA في المختبر.
- توصيل هذه المعقدات عن طريق التثقيب الكهربائي.
- تحديد معايير محددة للتثقيب الكهربائي (على سبيل المثال، 1,900 فولت، 20 مللي ثانية).
- التطبيق على الخلايا البلعمية الأولية المشتقة من نخاع عظم الفئران.
النتائج الرئيسية
- إثبات كفاءة عالية في تعطيل الجينات داخل الخلايا البلعمية.
- تمكين التلاعب الجيني السريع دون الحاجة إلى البلازميدات.
- إظهار قابلية تطبيق واسعة في مختلف أبحاث المناعة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة للتعديل الوراثي في الخلايا البلعمية.
- ويعالج هذا البروتوكول التحديات السابقة المتعلقة بكفاءة تعطيل الجينات.
- يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة في دراسات متنوعة في علم المناعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج التعطيل الفعال للجينات في الخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) الأولية عقبة حرجة في اكتشاف الأدوية التي تركز على علم المناعة، وذلك من خلال تمكين الجينوميات الوظيفية السريعة وعالية الموثوقية في الخلايا الأولية ذات الصلة بالمرض. وتدعم كفاءة التحرير العالية وسير العمل المبسط في هذا البروتوكول التحقق القوي من الأهداف والحد من المخاطر الآلية عند نقاط التحول المبكرة في عملية الاكتشاف. كما يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية لفرز محفظة المشاريع ويسرع ترجمة الرؤى الجينية إلى فرضيات علاجية قابلة للتنفيذ.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء المباشر لوظيفة الجين في البلاعم الأولية، مما يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية.
- يسهل التحقق السريع من الأهداف العلاجية في نظام ذي صلة فسيولوجياً.
- يدعم دراسات فقدان الوظيفة عالية الموثوقية لتوضيح المسارات.
- يحسن القيمة التنبؤية لقرارات المحفظة اللاحقة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز أنظمة خلايا أولية موثقة لعمليات الفحص المظهري اللاحقة.
- يقدم مخرجات كمية وقابلة للتكرار لتعطيل الجينات من أجل توحيد معايير المقايسة.
- يتيح سير عمل قابل للتوسع وخالٍ من البلازميدات، بما يتناسب مع حملات الفحص التكرارية.
- يدعم التقييم الموثوق لتأثيرات المركبات في الخلايا البلعمية المعدلة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط التعديل الجيني ببيولوجيا الخلايا البلعمية ذات الصلة بالمرض لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يسهل تطوير النماذج قبل السريرية باستخدام خلايا أولية ذات تعديلات جينية محددة.
- يقلل من المخاطر البيولوجية من خلال الربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري في الأنظمة الأولية.
- يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية والدراسات الميكانيكية في مسارات أبحاث المناعة.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
يدمج سير عمل CRISPR القائم على التثقيب الكهربائي هذا في مراحل الاكتشاف المبكرة والتحقق من الأهداف، مما يتيح انتقالاً سلسًا إلى تحديد المركبات الرائدة والأبحاث قبل السريرية في مسارات العمل المخصصة لعلم المناعة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتحليل المسارات في البلاعم الأولية.
- الفحص المسحي: يوفر تعطيلًا جينيًا كميًا وقابلًا للتكرار لضمان جاهزية المقايسة.
- التحليلات: يتيح قياس كفاءة التحرير بناءً على تسلسل سانجر لمقارنة الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يحافظ على الصلة بالمرض من خلال استخدام الخلايا الأولية في الدراسات الجينية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يقدم بروتوكولًا معياريًا وقابلًا للتطبيق على نطاق واسع للتلاعب الجيني عبر مشاريع المناعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تبسط سير العمل بكفاءة عالية وقابلية للتكرار، دون الحاجة إلى بناء البلازميد.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أسرع بشأن المتابعة أو التوقف وتخصيص الموارد بكفاءة رأسمالية.
- تأثير المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بأصول علم المناعة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الخلايا الأولية وتجميع معقدات CRISPR RNP.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة التثقيب الكهربائي (electroporation) وبنية تحتية لتسلسل سانجر (Sanger sequencing).
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان القابلية للتكرار في الدراسات متعددة المواقع.
- قد يلزم إجراء مواءمة لأنواع أخرى من الخلايا الأولية أو الأنواع الحيوية المختلفة.
- يجب التحقق تجريبياً من كفاءة التعديل وحيوية الخلايا لكل جين مستهدف.
