Name: تصميم وبناء مجهر مضان أحادي الهدف قابل للتخصيص لتصور شبكات الهيكل الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: تعلم بناء مجهر مضان أحادي الهدف لتصور شبكات الهيكل الخلوي ثلاثية الأبعاد. يوفر هذا البروتوكول دليلاً تفصيلياً لبناء نظام متعدد الاستخدامات مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة RUI للمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) (DMR-2203791) إلى JS. نحن ممتنون للإرشادات التي قدمها الدكتور بن يانغ والدكتور مانيش كومار خلال عملية المواءمة. نشكر الدكتورة جيني روس و K. Alice Lindsay على تعليمات التحضير لمحركات kinesin.

مجهر مضان قابل للتخصيص لتصور شبكات الهيكل الخلوي

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه. أجريت جميع الأبحاث في غياب العلاقات التجارية أو المالية التي يمكن تفسيرها على أنها تضارب في المصالح.

هناك تفصيلان مهمان فيما يتعلق بهذا البروتوكول هما التكلفة الإجمالية للنظام ووقت البناء والمحاذاة المتوقع. على الرغم من أن التكلفة الدقيقة متغيرة ، يمكننا أن نقدر بشكل مريح أن التكلفة الكاملة ل SOLS أو نظام DIY مشابه ستقع في حدود 85,000 دولار أمريكي. نلاحظ أن هذا التقدير يأخذ في الاعتبار سعر التجزئة لجميع المكونات ، لذلك قد يتم تخفيض هذا السعر الإجمالي بشكل كبير من خلال تحديد مصادر المكونات المستخدمة. من حيث وقت الإنشاء ، سيكون من المعقول توقع قيام مستخدم لديه خبرة قليلة في البصريات ببناء ومحاذاة نظام SOLS بأكمله في غضون 1-2 أشهر ، بشرط أن تكون جميع المكونات متوفرة وجاهزة. على الرغم من طول البروتوكول وتعقيده ، نعتقد أن مقدار التفاصيل في المخطوطة المكتوبة ، مقترنا ببروتوكول الفيديو ، يجب أن يجعل هذا البروتوكول مباشرا وسريعا في المتابعة.
هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. أولا ، يحدد موضع galvo موضع العديد من العدسات لأنه جزء من ثلاثة أزواج عدسات 4f منفصلة. من الأهمية بمكان أن يتم اقتران galvo مع المستويات البؤرية الخلفية ل O1 و O2 وتوسيطها بشكل صحيح لضمان المسح الضوئي الثابت للإمالة. ثانيا ، جودة الصورة حساسة للغاية لمحاذاة O2 و O3 فيما يتعلق ببعضهما البعض. هنا ، يجب توخي الحذر للتأكد من أن زاوية المحاذاة من O3 إلى O2 تتطابق أولا مع إمالة ورقة ضوء الإثارة ، وبالتالي توفير إضاءة مسطحة إلى أقصى حد عبر FoV المائل بالمثل. ثانيا ، يجب وضع O3 على المسافة المحورية الصحيحة للحفاظ على FoV مسطح بأكبر مساحة ممكنة. ثالثا ، يجب وضع O3 على المسافة الجانبية الصحيحة من O2 لتعظيم الإشارة التي تمر عبر واجهة O2-O3.

من حيث FoV القابل للاستخدام ، حقق هذا النظام مجالا مسطحا وموثوقا به مع إضاءة متسقة عبر مساحة 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر. هذه المنطقة أصغر من الحد الأقصى ل FoV الذي توفره الكاميرا ، لذلك يشار إلى FoV القابل للاستخدام بواسطة المربع الأصفر في الشكل 13. من حيث قوة الحل ، حقق هذا النظام مسافة قابلة للحل لا تقل عن 432 نانومتر على طول المحور السيني و 421 نانومتر على طول المحور ص ، والتي تم قياسها من خلال إيجاد متوسط سيغما x و y لتناسب غاوسيان لدوال انتشار النقطة (PSFs) في FoV الجيد والضرب في اثنين. نلاحظ أن هذا النظام لم يتم تحسينه من حيث إجمالي NA ، مما يعني أن هناك مجالا للتحسين الكبير إذا رغب المستخدمون في قوة حل أعلى مما حققه هذا النظام. هناك العديد من الخيارات الموضوعية المتوافقة لهذا النوع من بناء SOLS ، والتي سيساهم الكثير منها في دقة نظام أعلى ولكن مع عيوب التكلفة الأعلى أو FoV الأصغر أو تقنيات المحاذاة الأكثر تعقيدا في واجهة الترحيل8،11،13،20. بشكل منفصل ، إذا رغب المستخدمون في الحصول على FoV أكبر ، فإن دمج galvo ثان للسماح بمسح 2D سيحقق هذا الهدف ولكنه سيتطلب دمج بصريات وميكانيكا تحكم إضافية في التصميم32. لقد قدمنا مزيدا من التفاصيل حول التعديلات على النظام على صفحة موقعنا على الويب ، إلى جانب روابط لموارد مفيدة أخرى تتعلق بعملية التصميم23.

بالإضافة إلى تحسين المكونات المحددة لهذا التصميم المعين ، سيكون من الممكن جدا إضافة تقنيات أو طرائق مجهرية أخرى عالية الدقة إلى هذا البناء. أحد هذه التحسينات هو دمج الإضاءة متعددة الأطوال الموجية ، والتي ستتضمن محاذاة ليزر إثارة إضافي إلى مسار الإثارة الأصلي8. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذا النوع من تصميم SOLS يترك العينة متاحة ، فإن إضافة وظائف إضافية إلى المجهر ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الملقط البصري ، وعلم الموائع الدقيقة ، وقياس الريومترية ، يكون واضحا نسبيا 2,33.

مقارنة بأدلة ورقة الضوء التي لا تعد ولا تحصى التي تم نشرها ، يوفر هذا البروتوكول تعليمات على مستوى من الفهم قد يجدها المستخدم الذي ليس لديه خبرة كبيرة في البصريات مفيدا. من خلال إنشاء SOLS سهل الاستخدام باستخدام إمكانات تركيب شرائح العينات التقليدية في متناول جمهور أكبر ، نأمل في تمكين المزيد من التوسع في تطبيقات البحث القائم على SOLS في جميع المجالات التي تستخدم فيها الأداة أو يمكن استخدامها. حتى مع النمو السريع لتطبيقات أدوات SOLS في العدد2،34،35 ، نعتقد أن العديد من الفوائد والاستخدامات للأدوات من نوع SOLS لا تزال غير مستكشفة ونعرب عن الإثارة في إمكانيات هذا النوع من الأدوات للمضي قدما.

يمثل الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) عائلة من تقنيات التصوير الفلوري عالية الدقة التي يتشكل فيها ضوء الإثارة في ورقة 1,2 ، بما في ذلك مجهر الإضاءة المستوية الانتقائية (SPIM) ، والإثارة المستوية المحاذية للخلط (SCAPE) ، والمجهر المائل المستوى (OPM)3،4،5،6،7. على عكس طرق الفحص المجهري الأخرى مثل التألق الوبائي ، أو الفحص المجهري الفلوري الداخلي الكلي (TIRFM) ، أو الفحص المجهري متحد البؤر ، تكون السمية الضوئية ضئيلة في LSFM ويمكن تصوير العينات على مدى فترات زمنية أطول لأن مستوى العينة التي يتم تصويرها بنشاط فقط هو المضاء8،9،10. لذلك ، تعد تقنيات LSFM مفيدة للغاية لتصوير عينات 3D على مدى فترات زمنية طويلة ، ولا سيما تلك السميكة جدا لتقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. بسبب هذه الأسباب ، منذ تطويره الأصلي في عام 2004 ، أصبح LSFM تقنية التصوير المفضلة للعديد من علماء الفسيولوجيا وعلماء الأحياء التنموية وعلماء الأعصاب لتصور الكائنات الحية بأكملها مثل الزرد الحي وأجنة ذبابة الفاكهة 3،4،6،11. في هذين العقدين الماضيين ، تم الاستفادة من مزايا LSFM لتصور البنية والديناميكيات على نطاقات أصغر تدريجيا ، بما في ذلك الأنسجة11،12 ، والمقاييس الخلوية ، والخلوية ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر13،14،15،17.
على الرغم من تقارير حالات الاستخدام الناجحة في الأدبيات ، فإن التكلفة العالية لأنظمة LSFM التجارية (~ 0.25 مليون دولار أمريكي حتى وقت كتابة هذا التقرير)18,19 تمنع الاستخدام الواسع النطاق لهذه التقنية. لجعل تصميمات DIY بديلا مجديا للباحثين ، تم نشر أدلة بناء متعددة8،13،20،21 ، بما في ذلك جهد الوصول المفتوح OpenSPIM22. ومع ذلك ، حتى الآن ، يمكن للباحثين الذين لديهم الحد الأدنى من الخبرة البصرية استخدام تصميمات LSFM السابقة فقط ، والتي لا تتوافق مع العينات التقليدية المثبتة على الشرائح (الشكل 1 أ). يستخدم التنفيذ الأخير للورقة الخفيفة (SOLS) هدفا واحدا لكل من الإثارة والكشف (الشكل 1C) ، وبالتالي التغلب على القيود المتعلقة بالتوافق5،6،8،13،20. ومع ذلك ، فإن تكلفة تعدد استخدامات تصميم SOLS هي زيادة كبيرة في تعقيد البناء بسبب متطلبات هدفين إضافيين لترحيل مستوى الكائن وإزالة إمالته وإعادة تصويره على الكاميرا للتصوير (الشكل 1D). لتسهيل الوصول إلى الإعدادات المعقدة على غرار SOLS ، تقدم هذه الورقة دليلا تفصيليا حول تصميم وبناء وعملية محاذاة واستخدام نظام SOLS المتوافق مع الشرائح ، والذي سيكون مفيدا للباحثين الذين لديهم معرفة بدورة بصريات للمبتدئين فقط.
على الرغم من أن البروتوكول نفسه موجز ، يجب على القراء الرجوع إلى موارد أخرى أثناء خطوات الإعداد لمعرفة المزيد حول أجزاء معينة من اعتبارات التصميم أو الأجهزة. ومع ذلك ، إذا كان القارئ ينوي اتباع مواصفات هذا التصميم ، فقد لا يكون من الضروري فهم كيفية اختيار مكونات بصرية معينة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> الشكل 1: خصائص تكوينات LSFM المختلفة. (أ) الإعداد بهدفين متعامدين شائعين في تصميمات LSFM المبكرة. في هذا التكوين ، يتم استخدام أنبوب شعري أو أسطوانة من الجل لاحتواء العينة ، وهو أمر غير متوافق مع تقنيات تركيب الشريحة التقليدية. (ب) رسم تخطيطي لتصميم ورقة ضوئية SOLS يوضح ما يلي: (ج) الهدف الوحيد المستخدم لكل من الإثارة وجمع الانبعاثات في مستوى العينة (O1) ؛ يسمح ذلك بتركيب شريحة تقليدية في الأعلى ، و (د) نظام هدف الترحيل في مسار انبعاث SOLS. يجمع O2 ضوء الانبعاث ويزيل تكبير الصورة. يقوم O3 بتصوير المستوى بزاوية الميل الصحيحة على مستشعر الكاميرا. الاختصارات: LSFM = المجهر الفلوري للصفائح الضوئية ؛ SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ O1-O3 = الأهداف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

تصميم وبناء مجهر مضان أحادي الهدف قابل للتخصيص لتصور شبكات الهيكل الخلوي

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

ظهرت مركبات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها كنظام نموذجي قيم لدراسة المادة الرخوة غير المتوازنة. إن الالتقاط المؤمن لديناميات هذه الشبكات الكثيفة 3D يستدعي التقسيم البصري ، والذي غالبا ما يرتبط بالمجاهر البؤرية الفلورية. ومع ذلك ، فإن التطورات الأخيرة في الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) قد أثبتت أنها بديل فعال من حيث التكلفة ، وفي بعض الأحيان ، متفوق. لجعل LSFM في متناول باحثي الهيكل الخلوي أقل دراية بالبصريات ، نقدم دليلا للمبتدئين خطوة بخطوة لبناء مجهر مضان متعدد الاستخدامات من مكونات جاهزة. لتمكين تركيب العينة باستخدام عينات الشرائح التقليدية ، يتبع LSFM تصميم ورقة الضوء أحادية الهدف (SOLS) ، والتي تستخدم هدفا واحدا لكل من مجموعة الإثارة والانبعاثات. نصف وظيفة كل مكون من مكونات SOLS بتفاصيل كافية للسماح للقراء بتعديل الأجهزة وتصميمها لتناسب احتياجاتهم الخاصة. أخيرا ، نوضح استخدام أداة SOLS المخصصة هذه من خلال تصور زهور النجمة في شبكات الأنابيب الدقيقة التي يحركها كينيسين.

أجرينا مسحا حجميا لخرز 1 ميكرومتر مضمن في صمغ جيلان. يوضح الشكل 14 الإسقاطات القصوى للكثافة للمسح الحجمي المنحرف على طول الاتجاهات x و y و z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> الشكل 14: التصوير الحجمي لحبيبات الفلورسنت 1 ميكرومتر في صمغ جيلان. يتم عرض الإسقاطات القصوى لكثافة عمليات المسح الحجمي المنحرفة. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
لقد أثبتنا استخدام المجهر أحادي الهدف ذو الصفيحة الضوئية لتوصيف شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها عن طريق إجراء مسح حجمي لعينات من زهور النجمة ذات الأنابيب الدقيقة. باختصار ، تم بلمرة الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول الموسومة بالرودامين من الدايمرات المعاد تشكيلها بواسطة GTP. بعد البلمرة ، تم خلط مجموعات محركات كينيسين القائمة على الستربتافيدين في عينات جنبا إلى جنب مع ATP للتركيزات النهائية من 6 ميكرونبيبات ميكرومتر ، و 0.5 ميكرومتر من دايمرات كينيسين ، و 10 مللي متر ATP. يمكن العثور على بروتوكولات وأدلة شاملة لإعداد الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول ومجموعات محركات كينيسين على مواقع Mitchson Lab و Dogic Lab25,26. تم سحب العينات برفق في شرائح مجهرية ، ومختومة ، وسمح لها بالجلوس لمدة 8 ساعات قبل التصوير للسماح للنشاط الحركي بالتوقف بحيث وصلت العينات إلى حالة هيكلية ثابتة تشبه زهور النجمة.
غالبا ما تستخدم دراسات أنظمة الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها الفحص المجهري البؤري أو فوق الفلوري لتصوير خيوط موسومة. ومع ذلك ، فإن كل من هذه التقنيات محدودة في قدرتها على تصوير عينات 3D كثيفة27. في حين تم إحراز تقدم كبير في أبحاث المادة النشطة القائمة على الهيكل الخلوي في المختبر من خلال تقييد العينات لتكون شبه2D 28,29 ، فإن شبكات الهيكل الخلوي هي بطبيعتها ثلاثية الأبعاد ، والعديد من المساعي الحالية تكمن في فهم التأثيرات التي يمكن أن تنشأ فقط في عينات ثلاثية الأبعاد29,30 ، مما يخلق حاجة إلى تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> الشكل 15: تسهيل التصور ثلاثي الأبعاد لعينات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها بواسطة المجهر ذو الهدف الواحد. (أ) صور زهور النجمة الفلورية ذات الأنابيب الدقيقة التي تم الحصول عليها على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر Leica DMi8. تظهر الصور مستويات مختلفة من z-scan. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (B) صور منحرفة غير ملتفة من مسح حجمي تم إجراؤه على إعداد ورقة ضوئية أحادية الهدف لنفس العينة. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. تتوافق منطقة الصورة المنحرفة هنا مع FoV القابل للاستخدام (الصندوق الأصفر) الموضح في الشكل 13B. بينما يتفوق البؤر في تصوير الطائرات الفردية بالقرب من غطاء الغطاء ، فإن كثافة عينة الفلورسنت تحدث مضاعفات عند التصوير في مستويات أعلى بسبب الإشارة الإضافية من أسفل مستوى التصوير. تتحايل ورقة الضوء على هذه المشكلة من خلال إضاءة مستوى التصوير فقط ، مما يسمح بالتصوير الحاد بشكل موحد في مستويات مختلفة في z. الاختصارات: SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ FoV = مجال الرؤية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في الشكل 15 ، نوضح التصوير الحجمي لشبكة الأنابيب الدقيقة المعاد تشكيلها والتي تم تقليصها إلى هياكل تشبه النجمة بواسطة مجموعات محركات كينيسين. كما هو موضح في البحث السابق28,31 ، تميل هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى النمو بكثافة نحو المركز ، مما يؤدي إلى مناطق مشرقة من التألق السائدة في الإشارة. في طائرات التصوير بالقرب من غطاء الغطاء (مستوى z منخفض) ، يمكن للفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 15A) حل خيوط مفردة حول محيط النجمة ، مع خلفية إضافية نحو المركز بسبب إشارات مضان خارج التركيز من الأعلى. ومع ذلك ، فإن تحريك بضعة ميكرونات في z يقلل بسرعة من جودة الصور بسبب الأجزاء الكثيفة خارج التركيز البؤري من النجم السائدة في الإشارة في مستوى التصوير. تعمل الإضاءة أحادية المستوى لورقة الضوء (الشكل 15B) على التخلص من الإشارات خارج التركيز من الأجزاء الكثيفة من النجمة أعلى وأسفل مستوى التصوير ، مما يسمح بجودة صورة قابلة للمقارنة بين المستويات. إن قدرة الورقة الضوئية على إنتاج بيانات مسح حجمي عالية الجودة وموثوقة تفتح إمكانية تصور وتوصيف ظواهر 3D في أنظمة الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها.

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية بناء مجهر مضان أحادي الهدف وضوء ورقة واستخدامه لتصور شبكات الهيكل الخلوي.

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

يهدف عملنا إلى تعزيز المعرفة حول العلاقة بين ديناميكيات العمل العابر والبنية المحلية والخصائص الميكانيكية في المواد البعيدة عن التوازن. يتطلب تصور المواد البعيدة عن التوازن مثل شبكات الهيكل الخلوي القدرة على تصوير عينات كثيفة ثلاثية الأبعاد بجودة صورة مماثلة في جميع أنحاء حجم العينة ، مع التسبب في الحد الأدنى من الضرر عن طريق التبييض الضوئي ، وهي مهمة صعبة تقنيا أن الفحص المجهري للصفائح الضوئية الفلورية هو الأنسب لها. توفر أنظمة مجهر الصفيحة الضوئية الفلورية إمكانات تقسيم بصرية ممتازة ، مما يسمح بتصوير هذه العينات السميكة ثلاثية الأبعاد لمقاييس زمنية طويلة مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي.على وجه الخصوص ، يتوافق نظام ورقة الضوء ذات الهدف الفردي الذي سنقدمه مع العينات التقليدية المثبتة على الشرائح ، مما يجعله أداة متعددة الاستخدامات للغاية. تتم كتابة الغالبية العظمى من أدلة ورقة الضوء الموضوعية الفردية للمستخدمين ذوي الخبرة البصرية الواسعة. لجعل إعداد نمط ورقة الضوء الهدف الفردي المعقد أكثر سهولة ، يوفر هذا الدليل التفصيلي خطوات يمكن للمستخدم الذي لديه عمق معرفة دورة البصريات للمبتدئين اتباعها.

design-building-customizable-single-objective-light-sheet

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في كثير من الحالات السريرية والبيولوجية وأنه من المفيد لدراسة العمليات الخلوية لأنها تتطور في المكروية وطنهم. نحن هنا وصف التجمع ، واستخدام المجهر الألياف البصرية المنخفضة التكلفة التي يمكن أن توفر الوقت الحقيقي التصوير في خلية ثقافة والدراسات الحيوانية ، والدراسات السريرية المريض.

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

التصوير المجهري للخلايا البطانية يعيش معربا عن GFP - الأكتين يسمح توصيف التغيرات الدينامية في الهياكل هيكل الخلية. على عكس التقنيات التي تستخدم عينات ثابتة ، وهذا الأسلوب يوفر تقييما مفصلا للتغيرات الزمنية في الهيكل الخلوي الأكتين في الخلايا نفسها قبل وأثناء وبعد مختلف المحفزات المادية والدوائية ، أو التهابات.

دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; التنمية

ووصف وحدة لطائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) التي تتكيف بسهولة مع المجهر واسعة المجال المقلوب والأمثل لمزارع الخلايا 3 الأبعاد. يقع ضمن العينة الشعرية مستطيلة، وعبر نظام ميكروفلويديك الأصباغ الفلورية، وكلاء الصيدلانية أو المخدرات يمكن تطبيقها بكميات صغيرة.

طائرة واحدة ومنهج وحدة الإضاءة الجزئي الشعرية لالمجهر حقل واسع

يظهر هنا تحضير طبقات دهنية مستوية مدعومة بالزجاج المستوي الوظيفي ، وتحديد حركة البروتين داخل وقياس كثافة البروتين. تم تحديد خارطة طريق لبناء مجهر انعكاس داخلي إجمالي منخفض الضوضاء ، مما يسمح بتصور الفلوروكروم المقيم في طبقة ثنائية الطبقة بدقة زمانية مكانية عالية.

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

هنا، ونحن تصف نهج ورقة المجهر الضوئي لتصور القلب CD45 + الكريات البيض التسلل في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم العقيم، والذي يسببه العلاج داخل الخناق السموم علاج الفئران CD11c.DTR.

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

أصبح تصوير التشكل للأجنة الحشرات مع ضوء على أساس ورقة مضان المجهر الدولة من الفن. ويحدد هذا البروتوكول ويقارن ثلاث تقنيات التركيب المناسبة للأجنة خنفساء الدقيق الحمراء، ويدخل اثنين من رواية خطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب مناسبة تماما لتصوير العيش، ويناقش ضوابط الجودة الأساسية ويشير إلى القيود التجريبية الحالية.

مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة<em&gt; خنفساء الدقيق الحمراء</em&gt; الأجنة

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور الإسقاط الحركية وأربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا. بعد إيمونوستينينج للخلايا العصبية الحركية، استخدمنا الورقة الضوء الفلورية مجهرية للأجنة صورة للتحليل الكمي اللاحقة. ينطبق هذا البروتوكول على الأخرى عمليات الملاحة العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية

هذه الدراسة يستخدم تقنية مجهرية () ورقة الضوء فلورية إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع مسح بصري لدراسة قلب موريني.

ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين

ويرد وصف تعليمات مفصلة حول كيفية بناء يميل درجة عالية اجتاحت مجهر بلاط (هيست) واستخدامها لتصوير جزيء واحد.

دليل لبناء يميل درجة عالية اجتاحت بلاط المجهر لتصوير جزيء مفرد الحقل لعرض موسع

المجهر الفلوري القائم على الورقة الخفيفة هو الأداة الأكثر قيمة في علم الأحياء التنموي. ومن القضايا الرئيسية في الدراسات المقارنة التباين المحيط. يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لعينات متعددة ، وبالتالي ، يعالج هذه المشكلة بشكل نشط.

التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة

تعلم بناء مجهر مضان أحادي الهدف لتصور شبكات الهيكل الخلوي ثلاثية الأبعاد. يوفر هذا البروتوكول دليلاً تفصيلياً لبناء نظام متعدد الاستخدامات مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي.

تصميم وبناء مجهر مضان أحادي الهدف قابل للتخصيص لتصور شبكات الهيكل الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات