فحص تعديل الهستون باستخدام اللوني السائل ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة
يناير 12, 2024
سير عمل تحليلي يعتمد على الكروماتوغرافيا السائلة ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) للحصول على ثقة عالية وتحليل "من أسفل إلى أعلى" قابل للتكرار للغاية لتعديلات الهستون وتحديد الهوية بناء على المعلمات الرئيسية (وقت الاحتفاظ [RT] ، المقطع العرضي للتصادم [CCS] ، ونسبة الكتلة إلى الشحنة الدقيقة [m / z]).
تم اقتراح طريقة باستخدام بروتوكول استخراج الهستون بكفاءة 95٪. جنبا إلى جنب مع LC-TIMS-ToF MS / MS ، في وقت قصير ، من الممكن الحصول على فحص لتلك PTMs الموجودة في الهستون. وقبل كل شيء ، إمكانية فصل الأيزومرات.
غالبا ما يكون فصل الببتيدات الأيزومرية ممكنا باستخدام مطياف الكتلة الترادفي وحده أمرا صعبا. من خلال دمج TIMS ، نقدم بعدا إضافيا للفصل ، مما يبسط العديد من تحديدات الأيزومرات الموضعية. بالإضافة إلى ذلك ، تزيد التكنولوجيا السلبية من حساسية هذه التجارب ، مما يحسن قدرتنا على تحليل الاختلافات اللاجينية.
مع زيادة القدرة على تحديد مواقع PTM ، تأتي القدرة على تحديد العلاقة بين العوامل البيئية أو البيولوجية المختلفة ، وتأثيراتها على epigenome. يمكن تطبيق الطرق التي تعمل على تحسين وتسهيل تحليل الهستونات على العديد من مجالات البحث ، بما في ذلك الكيمياء الطبية والبيئية. سيتم إنشاء ديناميكيات تأكيد البروتين في الحالات الأصلية أو التالفة من تنفيذ TIMS MS / MS مع HDX.
من خلال LC-TIMS-ToF MS / MS و Nano LC-TIMS-ToF MS / MS ، سيتم رسم الاختلافات في PTM الموجودة في عينات بيولوجية مختلفة.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة سير عمل تحليلياً يستخدم الكروماتوغرافيا السائلة، ومطيافية حركية الأيونات المحبوسة، ومطيافية الكتلة بزمن الطيران (LC-TIMS-ToF MS/MS) للتحليل عالي الموثوقية لتعديلات الهيستون. وتعزز هذه الطريقة بشكل كبير من تحديد التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) والمتصاوغات الموضعية الخاصة بها.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- علم الوراثة فوق الجينية
خلفية علمية
- تلعب الهستونات دوراً حاسماً في تنظيم الجينات من خلال تعديلات متنوعة.
- يعد تحديد هذه التعديلات أمراً ضرورياً لفهم الآليات فوق الجينية.
- تواجه الطرق التقليدية تحديات في فصل المتصاوغات.
- يوفر دمج تقنية TIMS بُعداً جديداً لتحسين عملية الفصل.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة فعالة لاستخلاص الهستونات وتحليلها.
- تعزيز تحديد التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) وأيزومراتها.
- ربط العوامل البيئية بالتغيرات فوق الجينية.
الطرق المستخدمة
- بروتوكول استخلاص الهستونات الذي يحقق كفاءة بنسبة 95%.
- تقنية LC-TIMS-ToF MS/MS للتحليل عالي الدقة.
- تقنية سلبية لزيادة الحساسية في التجارب.
- فحص التعديلات ما بعد الترجمية (PTMs) الموجودة في الهستونات.
النتائج الرئيسية
- الفصل الناجح للببتيدات المتصاوغة باستخدام TIMS.
- تحسين تحديد مواقع تعديلات ما بعد الترجمة (PTM).
- تعزيز القدرة على تحليل الاختلافات فوق الجينية.
- الارتباطات المحتملة بين العوامل البيولوجية والإبيجينوم.
الاستنتاجات
- تؤدي الطريقة المقترحة إلى تحسين تحليل تعديلات الهيستونات بشكل ملحوظ.
- يساهم دمج تقنية TIMS في تسهيل عملية تحديد المتصاوغات.
- يفتح هذا النهج آفاقاً لمزيد من الأبحاث حول التأثيرات فوق الجينية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يلبي الفحص عالي الإنتاجية لتعديلات الهستونات ما بعد الترجمة (PTMs) باستخدام تقنية LC-TIMS-ToF MS/MS حاجة ماسة لرسم خرائط دقيقة فوق جينية في مراحل الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف. وتساهم القدرة على تحديد مواقع تعديلات PTM بثقة والتمييز بين الأشكال المتصاوغة في تعزيز الثقة التنبؤية في ربط الحالات فوق الجينية بالاستجابات البيولوجية. ويدعم سير العمل هذا اتخاذ قرارات المحفظة المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال تمكين تحليل كمي قوي لتعديلات الكروماتين ذات الصلة بآليات المرض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء آليات التنظيم فوق الجينية من خلال رسم خرائط عالية الموثوقية للتعديلات ما بعد الترجمة (PTM).
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال التمييز بين المتصاوغات الموضعية لتعديلات الهيستون.
- يسهل عملية تقليل المخاطر البيولوجية عن طريق ربط أنماط التعديلات ما بعد الترجمة (PTM) بالعوامل البيئية أو الجينية.
- يعزز الثقة التنبؤية لدفع الأهداف فوق الجينية في مسار عملية الاكتشاف.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز عينات بيولوجية مُصدقة لعمليات الفرز اللاحقة للمركبات المعدلة للكروماتين.
- يوفر ملفات تعريف كمية وقابلة للتكرار لتعديلات ما بعد الترجمة (PTM) لغرض توحيد المقاييس والمعايرة.
- يتيح تحليلاً عالي الإنتاجية وقابلاً للتوسع بما يتناسب مع حملات الفرز.
- يدعم التقييم الموثوق لتأثيرات المركبات على مشهد تعديلات الهيستون.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط الكشف عن تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) بالمؤشرات الحيوية فوق الجينية ذات الصلة بالمرض عندما يدعم سياق العينة ذلك.
- يوفر استمرارية من مرحلة رسم الخرائط فوق الجينية في مرحلة الاكتشاف إلى مرحلة التحقق من صحة النماذج قبل السريرية.
- يتيح التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال قياس التغيرات في تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) استجابةً للاضطرابات البيولوجية.
- يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية في الأبحاث الانتقالية من خلال التوصيف التفصيلي للتعديلات.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يدمج بروتوكول LC-TIMS-ToF MS/MS هذا المراحل بدءاً من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة، مما يدعم تدفقات العمل القائمة على الفرضيات وتلك القائمة على الفحص في أبحاث علم فوق الجينات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال ربط أنماط تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) بالنتائج البيولوجية.
- الفحص: توفر بيانات كمية لأنماط PTM جاهزة للمقايسات لتقييم المركبات وتقدير قابلية تكرار النتائج.
- التحليلات: تقدم قياسات عالية الدقة لمواقع PTM، وفصل المتصاوغات، وأطياف التجزئة لإجراء التحليل المقارن.
- الأبحاث الانتقالية: تتيح مواءمة ملفات PTM مع نماذج الأمراض واستراتيجيات المؤشرات الحيوية عند الاقتضاء.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة تحليلية قابلة لإعادة الاستخدام للدراسات فوق الجينية المستمرة عبر برامج متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف فوق الجينية.
- القيمة التشغيلية: توحد تحليل تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) مع إمكانية تكرار عالية وإنتاجية مرتفعة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات مدروسة بشأن المضي قدماً أو التوقف، وإدارة المحافظ بكفاءة رأسمالية.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للأهداف والبرامج فوق الجينية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس الطيف الكتلي، والكروماتوغرافيا، وتحليل بيانات البروتيوميات.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة LC-TIMS-ToF MS/MS المتقدمة والبرمجيات الداعمة لها.
- يستدعي توحيد معايير بروتوكولات تحضير العينات وتفسير البيانات بين الفرق المختلفة.
- قد يتطلب التكيف مع مختلف المصفوفات البيولوجية أو مصادر الهيستونات.
- تعد معايرة الأجهزة وتحسين الطريقة أمرين بالغَي الأهمية لضمان قابلية التكرار والحساسية.
