Name: تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: اكتشف طريقة تنقية تقاربية جديدة لإنزيمات تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus باستخدام الأرجينين أو الليسين. هذه التقنية البسيطة والفعالة تُحسّن دراسة الإنزيمات الحيوية وتطبيقاتها الطبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).

1. التحضير
<ol><li>علاج العينة<ol><li>تشريح بعناية S. nudus الطازجة (100 غرام) وجمع الأمعاء والسوائل الداخلية.</li>
		<li>أضف 300 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، درجة الحموضة 7.4) للتجانس (1000 دورة في الدقيقة ، 60 ثانية).</li>
		<li>تجميد ذوبان الجليد المجانس 3x.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي العينة (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) وجمع المادة الطافية. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.</li>
	</ol></li>
	<li>ترسيب البروتين<ol><li>امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ومتابعته لاحقا.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) للحصول على راسب البروتين ؛ قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.</li>
	</ol></li>
	<li>إعادة تعليق البروتين<ol><li>أعد تعليق راسب البروتين ب 30 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بتخزين محلول البروتين الخام هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.</li>
	</ol></li>
</ol>2. كروماتوغرافيا التقارب
<ol><li>ترشيح الحل<ol><li>قم بتصفية محلول البروتين الخام من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. احفظ هذه العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.</li>
	</ol></li>
	<li>تعبئة العمود<ol><li>قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة أرجينين - أغاروز وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز عن طريق تحميل كمية مناسبة من وسط مصفوفة ليسين - أغاروز ووسط مصفوفة أرجينين - أغاروز في أعمدة كروماتوغرافيا فارغة سعة 5 مل. ملاحظة: يمكن تخزين العمود عند 2-8 درجة مئوية ، مع غمر المصفوفة في مخزن مؤقت (20٪ إيثانول).</li>
	</ol></li>
	<li>تنقية التقارب<ol><li>قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا التقارب مع ddH2O أولا (1 مل / دقيقة ، 10 أحجام أعمدة) ، متبوعا بالمخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، pH 8.0 ، 1 مل / دقيقة ، 5 أحجام أعمدة).</li>
		<li>قم بتحميل عينة محلول البروتين على العمود المتوازن مسبقا (1 مل / دقيقة ، حجم 1/3 عمود). ملاحظة: يعتمد حجم تحميل العينة على تركيز sFE.</li>
		<li>اغسل العمود باستخدام المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، خمسة أحجام أعمدة).</li>
		<li>قم بتحريك العمود ب 0.15 M و 0.25 M و 0.35 M و 0.45 M و 0.55 M و 0.65 M NaCl (1 مل / دقيقة ، خمسة أحجام أعمدة) على التوالي.</li>
		<li>ابحث عن قمة الشطف التي يجب أن تظهر في شطف كلوريد الصوديوم 0.15 M ، ثم اجمع الكسور في أنابيب 5 mL.</li>
		<li>ركز عينة الشطف باستخدام مرشح طرد مركزي فائق 3 كيلو دالتون (3944 × جم ، 1.5 ساعة ، 4 درجات مئوية). قم بتخزين هذه العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تقييم النقاء
<ol><li>الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) إعداد هلام<ol><li>تحضير جل SDS-PAGE وفقا لطريقة ليملي باستخدام جل مركز 5٪ وجل فصل 12٪13.</li>
	</ol></li>
	<li>الكهربائي<ol><li>امزج العينة (15 ميكرولتر) مع مخزن مؤقت لتحميل البروتين SDS-PAGE 5x (حجم 1/4) ، وقم بتسخينه في الماء المغلي لمدة 5 دقائق ، وقم بتحميله على جل SDS-PAGE ، وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت ، 60 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة.</li>
	</ol></li>
	<li>تحليل<ol><li>بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتلطيخ الجل باستخدام Silver Stain Kit ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، ولاحظ الجل الملون باستخدام نظام تصوير كيميائي.</li>
		<li>تحليل نقاء البروتين المستهدف باستخدام الصيغة التالية: نقاء البروتين المستهدف = قيمة كثافة البروتين المستهدف / قيمة كثافة البروتين الكلي.</li>
	</ol></li>
</ol>4. تقييم نشاط تحلل الفيبرين
<ol><li>إعداد لوحة الفيبرين<ol><li>تحضير محلول الفيبرينوجين عن طريق خلط 25 ملغ من الفيبرينوجين مع 1.25 مل من المياه المالحة الفسيولوجية.</li>
		<li>تحضير محلول الثرومبين عن طريق خلط 100 وحدة من الثرومبين تماما مع 1.05 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي.</li>
		<li>تحضير محلول الأغاروز بإضافة 0.5 غرام من الأغاروز إلى 22.5 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 مول / لتر ، درجة الحموضة 7.4). اخلطي محلول الأغاروز وسخنيه على حرارة 100 درجة مئوية حتى يذوب تماما.</li>
		<li>قم بتبريد محلول الأغاروز إلى حوالي 50 درجة مئوية وأضف محلول الفيبرينوجين. ثم ، أضف محلول الثرومبين على الفور ، واخلطه بسرعة ، واسكبه في طبق استزراع 60 مم.</li>
	</ol></li>
	<li>تحميل<ol><li>لكمة الآبار 3 مم على ألواح الفيبرين المعدة باستخدام حفار معقم وملء الآبار بعينات 10 ميكرولتر.</li>
	</ol></li>
	<li>تحليل<ol><li>بعد 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بقياس نشاط تحلل الفيبرين عن طريق حساب حجم مناطقها المتحللة. نشاط تحلل الفيبرين = (حجم منطقة العينة / حجم منطقة يوروكيناز) × 100 وحدة حجم المنطقة = القطر × القطر. ملاحظة: تم استخدام المخزن الملحي الفسيولوجي والبروتين الخام (تم الحصول على العينة في خطوة البروتوكول 1.3.1) و urokinase للتحكم السلبي والتحكم الإيجابي ، على التوالي. بالمقارنة مع urokinase ، وجدنا أن النشاط التحلل للفبرين من sFE المنقى كان ~ 19200 وحدة / مل.</li>
	</ol></li>
</ol>

تنقية إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus عبر كروماتوغرافيا التقارب

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus14 الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، والقطبية15,16. لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول تنقية تقارب sFE حتى الآن. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول تنقية تقارب sFE بنجاح بناء على معرفة بنيته ال...

يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية 1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى 3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ، والتي يمكنها إذابة الجلطات مباشرة ولكن يتم تعطيلها بسرعة بواسطة مثبطات البلازمين المختلفة5. بعد ذلك ، تم الإبلاغ عن نوع جديد من عوامل تحلل الفيبرين يمكنه إذابة الجلطة ليس فقط عن طريق تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين ولكن أيضا عن تدهور الفيبرين مباشرة 6-إنزيم تحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني القديمة Sipunculus nudus (sFE)6. تمنح هذه الوظيفة الثنائية مزايا أخرى على أدوية التخثر التقليدية ، خاصة من حيث حالة البلازمينوجين غير الطبيعية. بالمقارنة مع عوامل تحلل الفيبرين ثنائية الوظيفةالأخرى 7،8،9 ، يعرض sFE العديد من المزايا ، بما في ذلك السلامة ، على العوامل غير المشتقة من الأغذية لتطوير الأدوية ، وخاصة بالنسبة للأدوية الفموية. وذلك لأن السلامة البيولوجية والتوافق الحيوي ل Sipunculus nudus كانت راسخة10.
على غرار العوامل الطبيعية الأخرى المحللة للفبرين المعزولة من الكائنات الحية الدقيقة وديدان الأرض والفطر ، فإن تنقية sFE من S. nudus معقدة للغاية وتتضمن مراحل متعددة ، مثل تجانس الأنسجة ، وترسيب كبريتات الأمونيوم ، وتحلية المياه ، وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون ، وكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء ، والغربلة الجزيئية10،11،12. لا يعتمد نظام التنقية هذا على المهارات المتقنة والمواد باهظة الثمن فحسب ، بل يتطلب أيضا عدة أيام لإكمال الإجراء بأكمله. لذلك ، فإن برنامج تنقية بسيط من sFE له أهمية كبيرة لمزيد من التطوير ل sFE. لحسن الحظ ، بلورتان من sFE (PDB: 8HZP ؛ PDB: 8HZO) بنجاح (انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). من خلال التحليل الهيكلي وتجارب الالتحام الجزيئي ، وجدنا أن النواة التحفيزية ل sFE يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالأهداف التي تحتوي على بقايا الأرجينين أو اللايسين.
هنا ، تم اقتراح نظام تنقية التقارب لأول مرة ، بناء على البنية البلورية ل sFE. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تنقية sFE عالي النقاء والنشط للغاية من المستخلصات الخام في مرحلة تنقية تقارب واحدة. البروتوكول الذي تم تطويره هنا ليس مهما فقط لإعداد sFE على نطاق واسع ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لتنقية عوامل تحلل الفيبرين الأخرى.

<table><tbody><tr><td>30٪ أكريلاميد - بيساكريلاميد (29: 1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الأمونيوم</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arginine-Sepharose 4B</td><td>مصفوفة Solarbio</td><td>Arginine-agarose</td><td></td></tr><tr><td>برومكسيلينول أزرق (BPB)</td><td>مجموعة وصمة عار Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Silver</td> Kit <td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinase</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysine-Sepharose 4B</td><td></td> مصفوفة <td></td>سولاربيو <td>ليسين أغاروز</td></tr><tr><td>N ، N ، N '، N '- تتراميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) علامة</td> بروتين <td>اللون Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prestained (10-170 kD) كلوريد</td> <td>الصوديوم Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td> <td>هيدروكسيد الصوديوم سيجما ألدريتش</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>سينوفارم</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ثرومبين</td><td>ميلونبيو</td><td></td><td></td></tr><tr><td>تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان</td><td>سولاربيو</td><td></td><td></td></tr><tr><td>تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد</td><td>سولاربيو</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><قوي > معدات < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>AKT نظام تنقية</td><td>البروتين GE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>النقيجهاز التعقيم بالبخار بالضغط العمودي الأوتوماتيكي MLS-3750</td><td>نظام التصوير الكيميائي SANYO</td><td></td><td></td></tr> مضخة <tr><td></td><td></td> التدفق المستمر <td></td><td></td></tr><tr><td>GE BT-100</td><td>QITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حاضنة درجة حرارة ثابتة</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي مبرد لسطح المكتب 3-30KS</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DHG سلسلة فرن التدفئة والتجفيف DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الخالط الزجاجي الكهربائي DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الميزان التحليلي الإلكتروني</td><td>دنفر</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي كهربائي ترموستاتي DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>شاكر إزالة اللون الأفقي</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>آلة الثلج AF 103</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E منظف بالموجات فوق الصوتية</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>النمام المغناطيسي</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مايكرو المبردة الطرد المركزي H1650-W</td><td>فرن</td> الميكروويف Cence <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q المرجع</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الماصة</td><td>الحرارية فيشر العلمية</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مقياس الأس الهيدروجيني الدقة لسطح المكتب</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مذبذب دوامة صغير الحجم</td><td>نظام الرحلان الكهربائي العمودي Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > المواد الاستهلاكية &nbsp ؛ < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 وميكرو ؛ L أنبوب PCR (200 & micro; L)</td> أنبوب الطرد المركزي <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1.5 مل) أنبوب</td><td></td> الطرد المركزي Biosharp <td></td><td></td></tr><tr><td>(5 مل) أنبوب</td><td></td> الطرد المركزي Biosharp <td></td><td></td></tr><tr><td>(50 مل) أنبوب</td><td></td> الطرد المركزي NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(7 مل) طبق</td> ثقافة <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 مم) غشاء</td> مرشح <td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0.22 & micro; م)</td> طرف ماصة <td>ميليكس جي بي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>بارافيلم</td><td>بيميس</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1 مل) طرف</td> ماصة <td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 وميكرو ؛ L)</td> طرف ماصة <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 & micro; L)</td> ورق المؤشر الخاص <td>من Axygene</td><td></td><td></td></tr> وحدة <tr><td>تصفية الطرد المركزي الفائق TZAKZY</td><td></td> (15 مل 3 كيلو دالة) وحدة تصفية الطرد المركزي الفائق Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td>(4 مل 3 كيلو دالة) كاشف</td><td></td> SSS لمؤشر الأس الهيدروجيني العالمي Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين - أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج محللات الأنسجة الخام ، وتم بناء مصفوفة أرجينين-أغاروز وأعمدة كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين-أغاروز ، وتم الحصول على sFE المنقى ، وتم قياس النقاء والنشاط التحلل للفبرين ل sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE وألواح الفيبرين ، على التوالي.
بعد الطرد المركزي ، كان الطافي الذي تم جمعه سائلا لزجا شفافا. بدأ هطول الأمطار عندما تم خلط هذا الطافع بمحلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات). بعد الوقوف لمدة 12 ساعة ، تم تشكيل راسب ثقيل في قاع الأنبوب. عندما تم إعادة تعليقه ...

هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

بحثنا هو أساسا حول تنقية انزيم تحلل الفيبرين. يحاول هذا العمل إنشاء طريقة تنقية بسيطة للإنزيم المحلل للفبرين. في هذا العمل ، أبلغنا عن نظام تنقية أرجينين أو ليسين أفضل تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين لأول مرة.بالمقارنة مع طرق التنقية التقليدية ، يعد هذا نهجا بسيطا وغير مكلف وفعال لتنقية الإنزيمات المحللة للفبرين من Sipunculus nudus. يعد تطوير هذا البروتوكول ذا أهمية أكبر لزيادة استخدام الإنزيمات المحللة للفبرين من Sipunculus nudus وغيرها من العوامل المماثلة.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

ماما هي فريدة من نوعها Magnetosome البروتينات المرتبطة بها والتي كانت معروضة على المشاركة في تنشيط magnetosome. هنا نقدم بروتوكول تنقية ماما الحذف متحولة (MamAΔ41)...

تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41

جنبا إلى جنب تقارب تنقية هو نهج قوي للتعرف على شركاء بروتين ملزمة. كدليل على المفهوم، تم تطبيق هذه المنهجية على eIF4E ترجمة جيدة تتميز عامل البدء إلى راسب المشترك العوامل الخلية المضيفة المشاركة في بدء الترجمة. ويتم تكييف هذه الطريقة بسهولة إلى أي بروتين خلوي أو فيروسي.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

هي غالباً ما تكون ملوثة البروتين integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف مع نوكلاس بكتيرية أثناء تنقية. هذا الأسلوب يعرف التلوث نوكلاس وإزالته من التحضير النهائي للانزيم.

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

يصف هذا البروتوكول كيفية استخراج البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetate من كبد الخنازير والفئران. يمكن تكييف الطرق المذكورة مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية وتعديلها للأنسجة الأخرى.

استخراج وتنقية بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والكلى والفئران

توفر هذه المقالة إجراء لتنقية تقارب بروتين بشري مؤتلف ، رفرف نوكلياز 1 (FEN1) ، والذي تم تصنيفه بعلامة 6X-histidine . يتضمن البروتوكول استخدام عمودين أيونات معدنية متميزين لتنقية البروتين الموسوم.

تنقية تقارب بروتين 6X-his-tagged باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل سريع البروتين 

هنا ، نقدم بروتوكول الرحلان الكهربائي لهلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد (PAGE) لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين ل Sipunculus nudus بسرعة.

الفصل السريع وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة في Sipunculus nudus من خلال هلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد الكهربائي

تصف هذه المقالة منهجية للإفراط في التعبير عن Nsp15 المؤتلف ، وهو نوكلياز سام ، في نظام تعبير C41 (DE3) ، متبوعا بتنقية البروتين الموسوم باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم. يمكن تكييف هذه البروتوكولات مع البروتينات السامة الأخرى الصعبة.

الإفراط في التعبير عن النويات السامة وتنقيتها من الإشريكية القولونية

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يتم تقديم بروتوكول لإنتاج وتنقية واستخدام حويصلات الغشاء الخارجي المعبأة بالإنزيم (OMV) مما يوفر ثباتا معززا للإنزيم للتنفيذ عبر تطبيقات متنوعة.

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

نحن هنا وصف البروتوكولات لتعطيل خلايا الثدييات من قبل الطحن الحالة الصلبة في درجة حرارة المبردة، إنتاج استخراج الخلايا من مسحوق الخلية الناتجة عن ذلك، وعزل بروتين المجمعات الاهتمام من جانب القبض على تقارب على الخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة ميكرون الحجم.

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

نصف هنا طريقة جديدة وقوية وفعالة لتنقية التقارب الترادفي (TAP) للتعبير عن مجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة وعزلها وتوصيفها. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتوصيف الكيميائي الحيوي للمجمعات المنفصلة بالإضافة إلى تحديد التفاعلات الجديدة والتعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم وظيفتها.

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

اكتشف طريقة تنقية تقاربية جديدة لإنزيمات تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus باستخدام الأرجينين أو الليسين. هذه التقنية البسيطة والفعالة تُحسّن دراسة الإنزيمات الحيوية وتطبيقاتها الطبية.

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

استكشف المزيد من الفيديوهات