تسمح الحقن المبسطة داخل الفخذ باستخدام الفئران الحية بتحليل نخاع العظم المستمر

تهدف هذه التقنية إلى مساعدتنا على فهم بيولوجيا تكون الدم الطبيعي والأمراض في نخاع العظام بشكل أفضل عن طريق حقن عينات من المرضى القيمة وزرعها بأمان في الفئران عن طريق الفم ، متبوعا بشفط نخاع العظام. من المعروف منذ فترة طويلة أنه من الأفضل زرع كميات صغيرة من العينات القيمة مباشرة في نخاع عظم الفئران للتجارب التي تتم عن طريق الحقن في الوريد. ومع ذلك ، لا توجد مقاطع فيديو فنية فعلية ، لذلك كانت تعتبر بشكل عام تقنية عالية العوائق.

يتيح بروتوكولنا تطعيم أي عينة قيمة بسهولة وأمان في الفأر بعدد قليل من الخلايا. هناك طلب كبير على هذه التقنية ، وبمساعدة هذا الفيديو ، يمكن لأي شخص تعلمها بسرعة. نأمل أن يتمكن الجميع من إتقان هذه التكنولوجيا والمساهمة بشكل كبير في تقدم العلوم.

للبدء في إعداد معلقات الخلايا مع ما يصل إلى 3 ملايين خلية عينة باستخدام 20 ميكرولترا من FACS أو وسيط الذوبان. احتفظ بها على الثلج قبل الحقن. تطهير الساق التي تحتوي على عظم الفخذ المراد حقنها بثلاث مجموعات من الدعك المتناوبة باستخدام مقشر بوفيدون اليود أو الكلورهيكسيدين وإسفنج شاش مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪.

قم بتثبيت الساق عن طريق الضغط على عظم الفخذ بأصابع الإبهام والسبابة. ادفع الساق إما بالخاتم أو الإصبع الخامس للحفاظ على ثني الساق من عظم الفخذ. تأكد من الوضع المناسب للحقن الناجح.

استخدم حافة إبرة فارغة معقمة 27G لنقر الوتر الرضفي أعلى عظم الفخذ. لضمان أفضل نقطة إدخال ، أدخل إبرة 27G بحقنة متصلة أسفل الوتر الرضفي مباشرة. ضعها بإحكام بين لقمة عظم الفخذ ، وقم بتدوير الإبرة للخارج وللأعلى لمحاذاة ذلك بالتوازي مع عمود عظم الفخذ.

قم بتدوير الإبرة في دوائر مع تقدمها إلى تجويف نخاع الفخذ. أدخل الإبرة حتى يكون هناك انخفاض ملحوظ في المقاومة. تأكد من وضع الإبرة الصحيح عن طريق الحركة الجانبية.

قم بإنشاء ضغط سلبي عن طريق سحب مكبس الإبرة للخلف أثناء تحريك الإبرة داخل تجويف نخاع العظم. تحقق من وجود دم أو نخاع في المحقنة للتأكد من وجود الإبرة في تجويف نخاع العظم. بعد التأكد من وضع الإبرة بشكل صحيح ، قم بإزالتها ببطء وأدخل الخلية التي تحتوي على حقنة من خلال نفس الجذر.

من المهم أن تتذكر جذر وزاوية الحقنة الأولى عند التبديل إلى إبرة جديدة. بمجرد حقن الخلايا بنجاح في عظم الفخذ ، قم بإزالة الإبرة والحقنة بعناية ، مع الحفاظ على الضغط على المحقنة. ثم قم بإزالة الماوس من مخروط الأنف وضعه على منشفة ورقية نظيفة لمنع شفط الفراش.

للتعافي ، احتفظ بالماوس على وسادة تسخين أو أي سطح آخر يتم التحكم فيه. تأكد من التعافي من التخدير قبل وضعها مرة أخرى على رف الماوس. راقب الفئران بحثا عن علامات الضيق أو العدوى خلال ال 24 ساعة القادمة.

ابدأ بالتحضير للإجراء قبل شفط نخاع العظام ، بلل حقنة 0.5 ملليلتر 27G مع CSM عن طريق ملء وطرد CSM مرتين إلى ثلاث مرات. ثم قم بشفط نخاع العظم برفق من الفأر المخدر ، مما ينتج عنه 20 إلى 50 ميكرولترا من نخاع العظام. ثم قم بإزالة الإبرة بالكامل من عظم الفخذ وتعليق العينة المستنشقة في 500 ميكرولتر من CSM.

أخرج الفأر من مخروط الأنف وضعه على منشفة ورقية نظيفة لمنع شفط الفراش أثناء الشفاء. راقب جميع الفئران للتحقق من التعافي من التخدير قبل وضعها على الجزء الخلفي من رف الماوس. خلايا الحبيبات من نخاع العظم مع خمس دقائق تدور عند 300 جرام عند أربع درجات مئوية.

شفط المادة الطافية وإضافة عازلة تحلل ACK إلى كل أنبوب. دوامة الخلايا لإعادة تعليقها وضعها على الجليد لمدة 5 إلى 10 دقائق. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون في أنبوب جديد.

اشطف الأنبوب الأصلي باستخدام عازلة FACS وقم بتمريره عبر شبكة النايلون ، وخلايا الحبيبات مرة أخرى عن طريق الدوران لمدة خمس دقائق عند 300 جم عند أربع درجات مئوية. استنشق المادة الطافية من الخلايا المحببة وأضف محلول التلوين الذي يحتوي على الأجسام المضادة المرغوبة. احتفظ بالأنابيب على الجليد لمدة 20 دقيقة.

اغسل الخلايا واستمر في تحليلها وفقا للإعداد التجريبي. يمكن تقييم تقنيات الزرع بسهولة مع الحد الأدنى من غزو الفئران باستخدام صورة التلألؤ البيولوجي. هنا لوحظ زرع خط خلية K562 مشتق من الإنسان باستخدام Acalook في نموذج فأر xenograft على جانب عظم الفخذ المحقون.

أدى زرع الخلايا الحسرية الإيجابية CD34 إلى أكثر من 10 إلى 20٪ من نقش الخلايا البشرية في ثمانية أسابيع بعد الزرع. وبالمثل ، أدى زرع الخلايا الجذعية العليا المشتقة من دم الحبل السري إلى نقش بشري يصل إلى 10٪ في ثمانية أسابيع بعد الزرع. تم تحقيق مزيد من عمليات الزرع الناجحة لمركبات HSPCs المشتقة من نخاع العظم البالغ ، والخلايا الجذعية لسرطان الدم ، و HSPCs المشتقة من دم الحبل السري المعدل من CRISPR Cas9 ، و AML iPSCs المشتقة من المريض باستخدام هذا الإجراء.