Name: دليل عملي للتطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: استكشف تقنية PRANCE لتطور البروتينات باستخدام الروبوتات والتحكم التلقائي في الوقت الفعلي. تُحسّن هذه الطريقة من نجاح التطور المستمر وتُمكّن من هندسة بروتينات حساسة للبيئة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر إيما تشوري وكيفن إسفلت على مساعدتهما ونصائحهما في إعداد الأجهزة والبرامج. يتم دعم سمير أودجان وأوسعيد أثير وإريكا ديبينيديكتيس من قبل منحة الباحث المبكر في ستيل بيرلوت. تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (CC2239) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (CC2239) ، وصندوق ويلكوم (CC2239).

إعداد PRANCE: دليل شامل للتطور المتسارع للروبوتات

<ol><li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472, 499-503 (2011).</li>
<li>Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+split+RNA+polymerase+as+a+versatile+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform.</a> Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).</li>
<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
<li>Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+directed+evolution+of+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Methods for the directed evolution of biomolecular interactions.</a> Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).</li>
<li>Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-assisted+continuous+evolution+%28PACE%29%3A+A+guide+focused+on+evolving+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions.</a> ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).</li>
<li>Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+directed+evolution+of+proteins+with+improved+soluble+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression.</a> Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).</li>
<li>Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-assisted+continuous+and+non-continuous+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phage-assisted continuous and non-continuous evolution.</a> Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).</li>
<li>DeBenedictis, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+molecular+evolution+enables+robust+biomolecule+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery.</a> Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Zhong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+continuous+evolution+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated continuous evolution of proteins in vivo.</a> ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).</li>
<li>Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-assisted+evolution+of+Bacillus+methanolicus+methanol+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2.</a> ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).</li>
<li>Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+high-throughput+biology+with+flexible+open-source+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation.</a> Mol Syst Biol. 17 (3), 9942(2021).</li>
<li>Novotny, C. P., Lavin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+effects+of+temperature+on+the+growth+of+F+pili%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Some effects of temperature on the growth of F pili.</a> J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).</li>
<li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).</li>
<li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterization+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLOS Biology. 18 (7), e3000794(2020).</li>
<li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise%2C+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

على الرغم من الجهود المبذولة لتوحيد المعدات ، من الناحية العملية ، سيكون كل إعداد PRANCE مختلفا بسبب التغييرات في توريد المعدات والأجهزة وإصدار البرامج. نتيجة لذلك ، يظهر كل إعداد PRANCE تحديات إعداد فريدة ، مما يتطلب فهما شاملا للغرض من كل مكون لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها المعيارية الفعالة.
تحدد هذه الطريقة بروتوكولا خطوة بخطوة لإعداد واختبار نظام PRANCE المعمول به. نركز أولا على العناصر الحاسمة للأجهزة والبرامج ثم نفصل الخطوات الأساسية للتحضير وإجراء سلسلة من عمليات الاختبار ، والتي تثبت أن النظام جاهز ل PRANCE.
تتمثل إحدى الميزات الأساسية للأجهزة في التحسين لتقليل مخاطر التلوث المتبادل للعينة أثناء التجارب المتعددة باستخدام البكتيريا. يوصى باستخدام أطراف تمت تصفيتها حصريا مع تقنية طرف الروبوت المتوافقة مع إعادة استخدام الطرف ويعتقد أنها تقلل من الهباء الجوي الناتج أثناء طرد الطرف عن طريق تجنب الأطراف المناسبة. يسمح غسل الأطراف القوي وفقا لهذا البروتوكول بإعادة استخدام الطرف على الرغم من أنه يجب التحقق من كفاية ذلك كجزء من اختبار العدوى على كل نظام. يعتمد التعقيم الذاتي أيضا على إمدادات ثابتة من الماء والتبييض للنظام. يتم تخزينها في خزانات / دلاء وإذا استنفدت ستؤدي إلى ضعف التعقيم الذاتي والتلوث المتبادل السريع. يمكن التقاط صور للخزانات / الدلاء التي تم التقاطها قبل وبعد تشغيل البرنامج لقياس معدل استهلاك معدات الغسيل للمياه والمبيض بالنظر إلى إعداد مضخة معين.
عنصر رئيسي آخر في النظام هو الحفاظ على مرحلة نمو البكتيريا ودرجة الحرارة. يتم إجراء تجارب PRANCE باستخدام سلالة بكتيريا S2060 E. coli (Addgene: # 105064). هذه سلالة تحتوي على بلازميد F مشتقة من K12 محسنة لتقليل الأغشية الحيوية7. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحرير F-plasmid في هذه السلالة بإضافة كاسيت مقاوم للتتراسيكلين لصيانة البلازميد ، luxCDE و luxR لاستكمال مراقبة التلألؤ بوساطة luxAB ، بالإضافة إلى lacZ تحت محفز صدمة العاثية للسماح بالتصور اللوني للويحات. يعد F-pilus المشفر بالبلازميد F ضروريا لعدوى العاثية M13. لذلك يجب استزراع البكتيريا المستخدمة في PACE عند 37 درجة مئوية وفي مرحلة منتصف السجل عندما يتم التعبير عن F-pilus12 وتكون عدوى العاثية M13 وانتشارها وتطورها ممكنة. لتنظيم درجة الحرارة الساكنة ، يمكن استخدام حامل لوحة ساخنة جاهزة. البديل هو ببساطة تسخين الهواء الداخل إلى مرشح HEPA باستخدام سخانات غير مكلفة ، على الرغم من أن هذا غير مستحسن لأنه قد يؤدي إلى تسارع التآكل والتلف على الأجهزة. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي ذلك إلى تسريع تبخر السوائل المساعدة على سطح السفينة ، مثل دلاء التبييض / الماء والمحفز ، عند استخدامها.
تعد معايرة حزم البرامج ضرورية أيضا لوظيفة النظام المناسبة. الاختلافات بين تخطيط سطح البرنامج ومجموعة الروبوت الفعلية هي السبب الأكثر شيوعا لفشل النظام أثناء التشغيل. تعد المعايرة المنتظمة للمضخات المساعدة التي تزود الثقافة البكتيرية والتبييض واستنزاف النظام أمرا حيويا لأن استخدام المضخة التمعجية يمكن أن يؤدي إلى تآكل الأنابيب وتغيرات حجم السوائل.
سيكشف اختبار تشغيل المياه بسرعة عن عدد من مشكلات الإعداد الشائعة ، بما في ذلك إعدادات معالجة السوائل غير الصحيحة ، وتسريبات السوائل / التوصيلات الخاطئة ، وعدم استقرار البرامج. لن يظهر تشغيل المياه الناجح أي تسرب سائل غير متوقع ويعمل بثبات دون أخطاء بين عشية وضحاها. هناك عدد من المشكلات الشائعة التي قد تنشأ أثناء تشغيل المياه مثل الفشل في تنفيذ بعض خطوات معالجة السوائل ، والتقطير من الماصات ، وتوقف البروتوكول في منتصف التشغيل. في حالة الفشل في تنفيذ بعض خطوات معالجة السوائل ، تأكد من تركيب جميع فئات السوائل. تسرد هذه اللزوجة وسرعات السحب المناسبة ويتم ضبطها في برنامج التحكم في الروبوت الذي توفره الشركة المصنعة. إذا كان هناك تقطير من الماصات ، فمن المهم أن تكون إعدادات ذراع سحب الروبوت صحيحة لتمكين السحب النظيف والقضاء على التلوث المتبادل للعاثيات. يتطلب السحب الروبوتي الناجح ، بالإضافة إلى فئات السوائل الصحيحة ، ارتفاعات تخطيط سطح السفينة الصحيحة لجميع أدوات المختبر ، وإزاحات ارتفاع السحب المناسبة المحددة في برنامج طريقة الروبوت PRANCE. قد تتطلب إزاحات الارتفاع هذه ضبطا مباشرا. إذا توقف البروتوكول في منتصف التشغيل ، فغالبا ما يتم إنشاء ذلك بواسطة مجموعة واسعة من الأخطاء التي تشير إلى أن ملف تخطيط سطح السفينة قد لا يتطابق مع تكوين سطح السفينة الفعلي.
سيكشف اختبار التشغيل البكتيري فقط عن مشكلات في إعدادات قارئ الألواح وتصور البيانات في الوقت الفعلي ، ومشاكل التركيز المفرط للتبييض أو الشطف غير الكافي ، واستقرار درجة الحرارة. سيظهر الجري الناجح للبكتيريا فقط توازنا في امتصاص البحيرة خلال الدورات الثلاث الأولى ، يليه امتصاص مستقر طوال مدة الجري. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكشف عن العديد من المشكلات الشائعة. هذه هي الخطوة الأولى حيث يتم رسم البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ اللوحة. قد لا يتم حفظ البيانات الموجودة في قاعدة بيانات قارئ اللوحات بشكل صحيح أو رسمها بشكل صحيح. إذا فشلت البكتيريا في التوازن في امتصاصها ، فقد يشير ذلك إلى أن تركيز التبييض مرتفع للغاية. يمكن أن يؤدي التبييض المفرط أو الغسيل غير الكافي إلى تعقيم التجربة بأكملها ، بدلا من مجرد قطعة من أدوات المختبر. في حالة الاشتباه في ذلك ، يمكن استخدام شرائط الكشف عن المبيض لاختبار البحيرة. يمكن التحقق من استقرار درجة حرارة الثقافة باستخدام مسدس ميزان الحرارة.
يشير اختبار العدوى الناجح إلى أن النظام جاهز لتشغيل PRANCE. يمكن إجراء اختبار العدوى عن طريق تلقيح مجموعة فرعية من البحيرات التي تحتوي على ثقافة بكتيرية. ستعبر هذه البكتيريا عن pIII عند الإصابة بالعاثية المناسبة التي تفتقر إلى جين pIII (ΔgIII) ، مما يسمح بانتشار العاثيات. أحد التوليفات الممكنة للاختبار هو استخدام بكتيريا S2060 المحولة باستخدام بلازميد يعبر عن pIII تحت محفز صدمة العاثية مع أي عاثية ΔgIII. نوصي باستخدام العاثية ΔgIII التي تحمل بوليميراز T7 RNA من النوع البري مع بكتيريا S2060 المحولة ببلازميد ملحق ، حيث يتم تشغيل pIII و luxAB بواسطة مروج T7 (Plasmid pJC173b13) ، كما هو موضح في الشكل 1. يسمح هذا أيضا بمراقبة العدوى بوساطة قارئ اللوحة أثناء تشغيل الاختبار. سيأتي الدليل القاطع على نجاح اختبار العدوى وعدم وجود تلوث متبادل من معايرة العاثيات لبحيرات الاختبار والتحكم. عند استخدام مراسل لوسيفيراز ، فإن زيادة التلألؤ في آبار الاختبار فقط ، كما هو موضح في الشكل 3 ، هي أيضا مؤشر على نجاح عدوى العاثيات وانتشارها. المعيار الذهبي لقياس عيار العاثيات هو مقايسةالبلاك 7. هناك أيضا بروتوكول للقياس الكمي M13 بواسطة qPCR7 قد يكون أسرع ، على الرغم من أن هذا لا يميز بين جزيئات العاثيات المعدية وغير المعدية وبالتالي قد يبالغ في تقدير التتر.
يشير البرنامج الرئيسي إلى ملف بيان ، وهو ملف قاعدة بيانات نص عادي ، والذي يملي حجم التخفيف لكل دورة لكل مزرعة تكاثر بالإضافة إلى اختيار أي عدد من المواد الأولية المحتملة للثقافة البكتيرية ، والتي قد تختلف في صرامة الاختيار. بهذه الطريقة ، يحدد ملف البيان العديد من معلمات تشغيل PRANCE. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحرير هذا الملف أثناء التشغيل إما بواسطة المشغل أو النظام ، مما يعني أنه يمكن إجراء التحكم اليدوي أو التلقائي في التغذية المرتدة.
تكمن فائدة إعداد PRANCE الذي يعمل بكامل طاقته في قدرته على التطور السريع لعدد كبير من السكان في بيئة يتم مراقبتها والتحكم فيها بعناية. يميز التنسيق القائم على اللوحة PRANCE عن التقنيات الأخرى ، مثل استخدام أنظمة أصغر قائمة على التوربيداتالجاهزة 14,15. لا يسهل الإعداد القائم على اللوحة التكامل السهل مع خطوات المعالجة الروبوتية الإضافية فحسب ، بل يسهل أيضا التوافق مع الأدوات المختبرية الأخرى مثل أجهزة الطرد المركزي. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على إجراء التطور المتسارع بشكل متزامن عبر حالات متعددة تقدم بعدا إضافيا للتجربة ، مما يعزز احتمال تحقيق نتائج متنوعة وقوية. يعزز نظام التحكم والتغذية المرتدة الحبيبي المتكامل في PRANCE إمكانية التنبؤ وموثوقية التجربة ، مما يمثل تقدما كبيرا في مجال تقنيات التطور الموجه. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية محدودة في عدد التجارب الموازية التي يمكن أن تجريها. اعتمادا على التكوين ، عادة ما تكون إعدادات PRANCE محدودة إما بسرعة سحب الروبوت أو من خلال مساحة سطح السفينة المتاحة.
يمكن أيضا تطبيق نفس الأجهزة والبرامج المستخدمة في PRANCE على طرق التطور التي لا تتضمن البكتيريا. كما هو موضح في طريقة multi-turbidostats11 ، يمكن استخدام هذه الأداة نفسها حصريا مع البكتيريا ، مما يتيح تجارب التطور التكيفي للجينوم الكامل. هذه القدرة على التكيف توسع نطاق هذه الأداة ، مما يمهد الطريق لأشكال جديدة من التطور المتسارع بالروبوتات.

PRANCE هو مزيج من اثنين من تقنيات التطور الموجهة القوية. الأول هو PACE1 ، وهي تقنية جزيئية تجمع بين جولات تنويع الجينات واختيارها بدورة الحياة السريعة للبكتيريا M13 ، مما يتيح حدوث جولات سريعة من التطور بشكل مستمر في ثقافة العاثيات السائلة. هذا الاختيار مدفوع باستخدام دائرة جينية مشفرة بالبلازميد تجمع بين وظيفة البروتين المتطور والتعبير عن pIII ، بروتين معطف الذيل M13 ، وهو ضروري لانتشار العاثيات ، وهذا موضح في الشكل 1. على المستوى التجريبي ، يسمح التخفيف المستمر لثقافة العاثيات السائلة بالاختيار المستمر. وبالتالي يمكن تعديل صرامة الاختيار على مستوى دائرة الجينات وكذلك على المستوى التجريبي من خلال التحكم في معدل تخفيف ثقافة العاثيات. لذلك يمكن تطبيق PACE على أي تحد هندسي للجزيئات الحيوية يوجد له مستشعر جزيئي يمكنه اكتشاف النشاط المطلوب في بكتيريا الإشريكية القولونية للحث على التعبير عن pIII. تشمل التطبيقات تطور ارتباط البروتينوالبروتين 2،3،4 ، وربط البروتين والحمض النووي5 ، وذوبان البروتين6 ، والعديد من الوظائف الأنزيمية المحددة7. والثاني هو التطورالمتسارع بالروبوتات 8,9 ، والذي يستخدم وحدة تحكم في التغذية المرتدة للقضاء على وضعين شائعين للفشل في التطور الموجه: الانقراض ، الذي يحدث عندما تكون البيئة صارمة للغاية ، ونقص التطور ، والذي يحدث عندما تكون البيئة متساهلة للغاية. على عكس المرور التسلسلي للعاثيات كما هو الحال في PANCE (التطور غير المستمر بمساعدة العاثيات)7،10 ، يتضمن التطور "شبه المستمر" المتسارع بالروبوتات سحب سريع يحافظ على الثقافات في مرحلة منتصف السجل ، مما يسمح للسكان بتجربة دورات مستمرة من العدوى والتكاثر. عندما يتم استخدام هاتين التقنيتين معا ، يشار إليهما باسم PRANCE ، للتطور شبه المستمر بمساعدة العاثياتوالروبوتات 8 ، والذي يتيح التطور المستمر القوي والمضاعف والسريع. تم استخدام PRANCE لتطوير البلمرة ، tRNAs ، وتوليفات amino-acyl tRNA والقيام بالتحكم في التغذية المرتدة خلال تلك التطورات لتحسين سرعتها وموثوقيتها8.
هناك العديد من التفاصيل حول إعداد الأجهزة والبرامج ل PRANCE التي تمكن من استخدام البكتيريا على روبوت معالجة السوائل. بدلا من استخدام البرامج الافتراضية التي توفرها الشركة المصنعة للروبوت ، نستخدم حزمة برامج مفتوحة المصدر قائمة على Python11 ، والتي تتيح التنفيذ السريع والمتزامن وبالتالي القدرة على الحفاظ على المفاعلات الحيوية شبه المستمرة في مرحلة منتصف السجل. يمكن تمديد وقت عدم تدخل الباحث إلى عدة أيام من خلال وجود العديد من المكونات الموجودة على سطح السفينة بشكل روتيني ، ويتم تحقيق ذلك من خلال التحكم التلقائي في المضخات التي يمكنها تبييض هذه المكونات وشطفها. يمكن القضاء على التلوث المتبادل للعاثيات عن طريق استخدام روبوت مناولة السوائل الذي لا يستخدم نصائح ملائمة للقوة وتعديل دقيق لإعدادات معالجة السوائل.

<table><tbody><tr><td>خزان البكتيري المطبوع ثلاثي الأبعاد "الوافل"</td> <td>-</td><td></td> <td>https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view ؛ لطابعة 3D سطح الروبوت</td></tr><tr><td></td><td>FormLabs</td><td>Form 3B +</td> <td>3D مكونات طابعة</td></tr><tr><td>3D راتنج طابعة ثلاثية الأبعاد (واضح)</td> <td>FormLabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td>مستهلكة للطابعة ثلاثية الأبعاد</td></tr><tr><td>8-1،000 & L رئيس</td><td>هاميلتون</td><td>10140943</td><td>لمعالجة السوائل روبوت</td></tr><tr><td>96-1,000 & رأس ماصة L</td><td>هاميلتون</td><td>10120001</td><td>لروبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td>قارئ ألواح البوليسترين الأسود الألواح الدقيقة</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3603</td><td>لسطح الروبوت</td></tr><tr><td>BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>10086700</td><td>لمعالجة السوائل</td></tr><tr><td>روبوت محلول</td><td>التنظيف Fluorochem Limited</td><td>F545154-1L</td><td>المستخدمة لتنظيف أجزاء مناولة السوائل في الروبوت</td></tr><tr><td>ألواح الآبار العميقة</td><td>أبليتون وودز</td><td>ACP006</td><td>تستخدم لاحتواء البكتيريا المتطورة على سطح</td></tr><tr><td>سخان الروبوت</td><td>Stego</td><td>13060.0-01</td><td>يسخن داخل حاوية الروبوت</td></tr><tr><td>هاميلتون ستار</td><td>هاميلتون</td><td>870101</td><td>لمعالجة السوائل</td></tr><tr><td>روبوت</td><td>سخان Erbauer</td><td>BGP2108-25</td><td>لروبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td>HIG Bionex جهاز الطرد المركزي</td><td>هاميلتون</td><td>10086700</td><td>لروبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td>iSWAP لوحة القابض</td><td>هاميلتون</td><td>190220</td><td>لأنابيب مختبر روبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td></td><td>Z280356 شركة ميرك</td><td></td><td>لبناء مشعب مناولة السوائل</td></tr><tr><td>إلى موصل شوكة</td><td>AIEX</td><td>B13193 / B13246</td><td>لتوصيل الأنابيب</td></tr><tr><td>لوحة التحريك المغناطيسية</td><td>Camlab</td><td>SKU - 1189930</td><td>لذراع الماصة الملولية للثلاجة</td></tr> المساعدة <tr><td></td><td>هاميلتون</td><td>173051</td><td>لروبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG labtech</td><td>5.7</td><td>برنامج التحكم في قارئ الألواح</td></tr><tr><td>طريقة واحدة فحص الصمامات</td><td>Masterflex</td><td>MFLX30505-91</td><td>إلى أقسام أحادية الاتجاه من مشعب مناولة السوائل</td></tr><tr><td>pyhamilton</td><td>MIT / مفتوح المصدر</td><td>https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE</td><td>برنامج التحكم في روبوت بايثون مفتوح المصدر</td></tr><tr><td>pymodbus</td> مفتوح <td>المصدر</td><td>3.5.2</td> واجهة <td>برنامج مضخة بايثون</td></tr><tr><td>يسمح</td><td></td><td>FSC175H</td> باستخدام <td>البكتيريا المبردة بدلا من Turbidostat</td></tr><tr><td>S2060 سلالة بكتيرية</td><td>Addgene</td><td>Addgene: # 105064</td><td>E. قولونية</td></tr><tr><td>درجة الحرارة وحدة تحكم</td><td>Digiten</td><td>DTC102UK</td><td>تستخدم للتحكم في السخانات حراريا</td></tr><tr><td>وحدة تحكم تبديل ترموستات</td><td>WILLHI</td><td>WH1436A</td><td>WILLHI WH1436A 10 A تحكم في درجة الحرارة 110 فولت مفتاح ترموستات رقمي Sous Vide Controller NTC 10K Sensor نسخة محسنة ؛ لروبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td>Venus</td><td>Hamilton</td><td>4.6</td><td>برنامج التحكم في الروبوت</td></tr><tr><td>الخاص محطة غسيل ل MPH 96/384</td><td>هاميلتون</td><td>190248</td><td>لروبوت مناولة السوائل</td></tr> <tr><td><قوي> المضخات المقترحة المصنعين < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > الشركة < / قوي ></td> <td>< قوي > رقم الكتالوج </td> <td> Notes </td> <td> Documentation </td></tr> <tr><td>Agrowtek</td><td>AD6i مضخة</td><td></td> <td>سداسيةhttps://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf</td></tr> محرك أقراص <tr><td>رقمي Amazon</td><td>INTLLAB 12V DC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-3</td><td>Masterflex L / S ، 100 دورة في الدقيقة ، 115/230 فولت تيار متردد</td><td>https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf</td></tr><tr><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07554-80</td><td>Masterflex L / S Economy متغير السرعة ، 7 إلى 200 دورة في الدقيقة ، 115 فولت تيار متردد</td><td>https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf</td></tr></tbody></table>

دليل عملي للتطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات

A Practical Guide to Phage- and Robotics-Assisted Near-Continuous Evolution

تعمل تقنيات التطور المعجلة بالروبوتات على تحسين موثوقية وسرعة التطور باستخدام التحكم في التغذية المرتدة ، مما يحسن نتائج تجارب تطور البروتين والكائن الحي. في هذه المقالة ، نقدم دليلا لإعداد الأجهزة والبرامج اللازمة لتنفيذ التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (PRANCE). يجمع PRANCE بين التطور الجزيئي السريع القائم على العاثيات والقدرة على إجراء مئات تجارب التطور المستقلة التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة في وقت واحد. سوف تصف هذه الورقة متطلبات الأجهزة والإعداد ل PRANCE ، بما في ذلك أداة معالجة السوائل ، وقارئ الألواح ، والمضخات المساعدة ، والسخانات ، والحاويات المطبوعة 3D. وصفنا كيفية تكوين روبوت معالجة السوائل ليكون متوافقا مع البرامج مفتوحة المصدر المستندة إلى Python. أخيرا ، نقدم اقتراحات لأول تجربتين يمكن إجراؤهما باستخدام نظام PRANCE الذي تم إنشاؤه حديثا والذي يمارس قدراته ويتحقق من أن النظام جاهز لإجراء تطور متعدد الإرسال. يهدف هذا الدليل إلى أن يكون بمثابة كتيب للتنقل في إعداد المعدات الكبيرة المرتبطة بإجراء التطور المتسارع للروبوتات.

نتائج اختبار العدوى سيكشف هذا الاختبار عن مشاكل في الثقافة البكتيرية ، واستنساخ العاثيات والعيار ، واستقرار درجة حرارة المعدات ، وإعدادات معالجة السوائل ، وتكامل قارئ اللوحة. سيكشف اختبار عدوى العاثية الناجح عن إصابة واضحة وسريعة بالعاثيات في البحيرات الملقحة بالعاثيات ، ولا توجد إشارة في البحيرات الخالية من العاثيات. يوضح الشكل 10 بعض النتائج التمثيلية لاختبار عدوى العاثيات. يمكن أيضا مقارنة النتائج التجريبية بالشكلين 1d و 1c من ورقة PRANCE8 هذه ، اعتمادا على ما إذا كان يتم تنفيذ تكوين "PRANCE الساخن" (الذي يغذيه توربيدوستات بكتيري حي) أو "PRANCE البارد" (الذي تغذيه ثقافة مرحلة منتصف السجل المبردة). قد يكشف هذا الاختبار عن العديد من المشكلات الشائعة. غالبا ما تؤدي المشكلات المتعلقة بإعداد الثقافة البكتيرية إلى ضعف العدوى أو غيابها. لا يمكن أن تصاب البكتيريا على النحو الأمثل إلا ب M13 phage عندما تكون في مرحلة منتصف السجل وعند 37 درجة مئوية. في درجات الحرارة ومراحل النمو الأخرى ، تظهر تعبيرا أضعف وبالتالي تكون أقل عرضة للإصابة بالعاثيات12. يمكن أن يؤدي التلقيح باستخدام عاثية منخفضة العيار ، أو عاثيات مع طفرات العمود الفقري إلى تأخر الإشارة أو غيابها. سيتم الكشف عن المشكلات المتعلقة بإعدادات كسب قارئ اللوحة للتألق أو التلألؤ من خلال هذا الاختبار.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig01v4.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي للدائرة الوراثية التي تعمل أثناء تشغيل اختبار العدوى لجهاز PRANCE. عندما يصيب بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ، المشفر على جينوم العاثية ، مضيف الإشريكية القولونية ، يتم نسخه وربطه على AP في مروج T7 ، مما يؤدي إلى نسخ بروتين pIII phage وبروتين luxAB ، والذي بدوره يسهل انتشار العاثية وإنتاج التلألؤ. الاختصارات: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات ؛ AP = بلازميد ملحق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig02.jpg"> الشكل 2: رسم تخطيطي للمكونات الفيزيائية لنظام PRANCE. تخزن الثلاجة الثقافات المثارة ، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى سطح الروبوت بواسطة مجموعة من المضخات ، إلى الخزان البكتيري ، "الوافل". يستخدم روبوت مناولة السوائل لنقل المزارع البكتيرية من "الوافل" باستخدام رأس السحب إلى الآبار القابضة للتدفئة إلى درجة حرارة الحضانة ، ثم إلى البحيرات حيث تحدث الحضانة الرئيسية. كل من الآبار القابضة والبحيرات هي ألواح آبار عميقة قياسية سعة 2 مل. يأخذ الروبوت العينات إلى لوحات القارئ ذات الاستخدام الواحد ، والتي يتم نقلها بدورها إلى قارئ الألواح للقياس. اختصار: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig03.jpg"> الشكل 3: الجهاز الروبوتي PRANCE. (أ) إعداد PRANCE. (I) فلتر HEPA وسخان خارجي. (II) ثلاجة الثقافة. (III) حاوية الروبوت الرئيسية. (IV) قارئ اللوحة. (V) المضخات والخزانات. (ب) حاوية الروبوت. (VI) مضخات الاستزراع الرئيسية. (سابعا ) خزانات المياه والنفايات والمبيض. (VIII) مضخات الغسالة. (ج) حاوية الروبوت. (IX) ذراع سحب الروبوت والقابض. (X) أطراف الماصة. (XI) مكون 3D مطبوع للسماح بتوزيع الثقافة على الروبوت ("الهراء"). (XII) لوحات لأخذ العينات في قارئ اللوحة. (XIII) دلاء لغسل الأطراف. (XIV) "البحيرات": أوعية الاستزراع التي تحدث فيها الزراعة التطورية. الاختصارات: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات ؛ HEPA = هواء جسيمات عالي الكفاءة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig04.jpg"> الشكل 4: تخطيط سطح السفينة. (أ) تمثيل 3D لتخطيط سطح السفينة في برنامج التحكم في الروبوت. (ب) صورة فوتوغرافية لمكونات سطح السفينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig05.jpg"> الشكل 5: لقطة شاشة لسطر الأوامر مع مثال على المعلمات (أعلاه) وتشغيل برنامج التحكم (أدناه). يوجد زر التشغيل في أعلى اليسار ويمكن النقر عليه بالماوس أو تشغيله بشاشة تعمل باللمس اعتمادا على التنفيذ المحلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig06.jpg"> الشكل 6: ملف بيان وحدة التحكم كما تم تكوينه لعمليات الاختبار. ستكون البحيرات التي تحتوي على ثقافة # 0 في العمودين 1 و 3 من لوحة البئر العميقة 96. ستكون الأعمدة المتبقية فارغة. يتم تمييز الصفوف A و B و D و E من لوحة البئر العميقة 96 على العمود الأيمن للعدوى بالعاثية (1) ، والصفوف الأخرى (0) عبارة عن عناصر تحكم بدون عاثيات. سيؤدي هذا المثال من بيان وحدة التحكم إلى قيام البرنامج بتخفيف البحيرة ب 210 ميكرولتر من الاستزراع كل دورة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig07.jpg"> الشكل 7: حساب معدل التخفيف الفعال للبحيرة باستخدام جدول بيانات DilutionCalculator. راجع الملف التكميلي 2 لجدول بيانات DilutionCalculator. كما هو موضح في هذا الشكل ، فإن بحيرة 550 ميكرولتر مخففة بمقدار 210 ميكرولتر من المستنبتة الطازجة كل دورة مدتها 30 دقيقة ، مع عينات 150 ميكرولتر لقياس لوحة القارئ التي يتم أخذها كل أربع دورات ستتوافق مع معدل تخفيف فعال يبلغ 1.0 حجم البحيرة / ساعة (بعد كل ساعة واحدة ، سيبقى 50٪ من سائل البحيرة الأصلي في بداية الساعة) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا شكل.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig08.jpg"> الشكل 8: نظام سخان الروبوت. يتم تنشيط السخان عن طريق توصيل مصدر الطاقة كما هو موضح بالدائرة الحمراء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig09.jpg"> الشكل 9: إعدادات بروتوكول إزالة التلوث بالأشعة فوق البنفسجية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig09large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig10.jpg"> الشكل 10: قياس اختبار العدوى الذي يتم إجراؤه على نظام PRANCE. يتم أخذ العينات أثناء الجري ويتم إجراء قياسات التلألؤ والامتصاص. لكل بحيرة ، يتم تقسيم قياسات التلألؤ حسب قياس الامتصاص المقابل ويتم رسمها كدالة للوقت. البحيرات المصابة بالعاثيات ملونة باللون الأخضر ، في حين أن بحيرات التحكم غير المصابة ملونة باللون الأسود. اختصار: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig10large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1: ملف STL للطباعة ثلاثية الأبعاد لمكونات السطح المخصصة المطلوبة لنظام PRANCE ، بما في ذلك ، على الأقل ، مشعب الخزان / التوزيع البكتيري ("الهراء"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/waffle_mini%20(1).zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: جدول بيانات حاسبة التخفيف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974_SI%20DilutionCalculator.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (PRANCE) هو تقنية لتطور البروتين السريع والقوي. تسمح الروبوتات بتوازي التجارب والمراقبة في الوقت الفعلي والتحكم في التغذية الراجعة.

Robotics-accelerated Evolution techniques improve the reliability and speed of evolution using feedback control, improving the outcomes of protein and ...

نحن نحاول أن نجعل عملية التطور الغامضة قابلة للتنبؤ بما يكفي لاستخدامها في الهندسة. يمنحنا PRANCE القدرة على إدخال التطور في الجدول الزمني للمختبر مع التوازي لفهمه بشكل أفضل. تجلب أتمتة المختبرات مفاهيم من هندسة البرمجيات العامة ، بما في ذلك الذكاء الاصطناعي إلى تطوير كود التحكم.يقوم الأشخاص أيضا بدمج أذرع المناور وأنظمة النقل متعددة الاتجاهات في منصات مناولة السوائل. بشكل عام ، تتضمن الأتمتة أجهزة وسير عمل أكثر تقدما. يعمل التحكم في التغذية المرتدة على تحسين نجاح التطور المستمر عن طريق منع أنماط الفشل الشائعة مثل الانقراض.هذا ضروري أثناء التطورات المتعددة حيث يكون للجزيئات أنشطة بدء مختلفة وصرامة التطور الديناميكي أمر بالغ الأهمية لتحقيق النتائج المرجوة. تتضمن الأسئلة العلمية الجديدة استكشاف كيفية تأثير الظروف المختلفة على التطور ، والنظر في التأثيرات على انتشار العاثيات وكفاءة دائرة التطور. مع أدوات هندسة البروتين المحسنة هذه ، نتطلع إلى هندسة بروتينات أكثر تطورا حساسة لبيئتها وديناميكية في الوظيفة.

a-practical-guide-to-phage-robotics-assisted-near-continuous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

في هذا الفيديو ، نناقش تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، qPCR ، لتعداد العاثيات T7 من خلال القياس الكمي للحمض النووي. ترتبط الصبغة الفلورية في خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل بخيوط الحمض النووي المركبة حديثا وتنبعث منها مضان يتم قياسه.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتعداد العاثيات

ووصف الأسلوب مع مرافقة البصرية لإجراء قابلة لل، التحديدات إنتاجية عالية من اندماجي المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج ضد المئات من مولدات المضادات في وقت واحد. باستخدام هذا النهج الموازي، ونحن قد عزل شظايا الأجسام المضادة التي تظهر تقارب عالية وخصوصية لمستضدات المتنوعة التي وظيفية في المناعية القياسية.

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

هنا ، نقدم مناهج ظاهرية للتوصيف الوظيفي لجينات العاثيات المفترضة. تشمل التقنيات فحصا متطورا قادرا على مراقبة التمثيل الغذائي الابتنائي للمضيف ، ولوحات الفحص متعددة الأنماط الظاهرية (MAPs) ، بالإضافة إلى الطريقة المعمول بها في التمثيل الغذائي ، القادرة على قياس التأثيرات على التمثيل الغذائي التقويضي.

Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

قد تم تصميم جيل جديد من المنصات ترجمة النسخ خالية من الخلية لبناء النظم البيوكيميائية في المختبر من خلال تنفيذ الدوائر الجينات. في هذه المقالة، يصف لنا كيف bacteriophages، مثل MS2 و ΦΧ174 و T7، يتم توليفها من الجينوم استخدام نظام تكستل كولاي كل خلية خالية.

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

تسمح البروتوكولات وصف البناء والتوصيف والتحديد (مقابل الهدف المفضل) من مكتبة "دوماينومي" من أي مصدر الحمض النووي. يتحقق ذلك من خلال خط أنابيب بحث الذي يجمع بين التكنولوجيات المختلفة: عرض بالعاثية، مراسل للطي وتسلسل الجيل القادم مع أداة ويب لتحليل البيانات.

إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

ويرد وصف استنساخه، ودقيقة، والوقت كمي PCR (qPCR) طريقة فعالة لتعداد عاثية T7 هنا. البروتوكول يصف بوضوح بالعاثية المجينية الحمض النووي إعداد وإعداد رد فعل بكر وظروف ركوب قبكر وتحليل البيانات قبكر.

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

يتيح اطار ايفولفير للثقافة الميكروبية المستمرة عاليه الانتاجيه بدقه عاليه وتحكم ديناميكي علي المعلمات التجريبية. يوضح هذا البروتوكول كيفيه تطبيق النظام لاجراء تجربه اللياقة البدنية المعقدة ، وتوجيه المستخدمين علي برمجه التحكم الألى علي العديد من الثقافات الفردية ، وقياس ، وجمع ، والتفاعل مع البيانات التجريبية في الوقت الحقيقي.

تصميم الألى ، عاليه الانتاجيه ، والمستمر تجارب نمو الخلايا باستخدام ايفولفير

إنشاء أنظمه البروتين المستحث كيميائيا مع التقارب والخصوصية المطلوبة لأي من الجزيئات الصغيرة المعطية والتي تحتوي علي العديد من تطبيقات الاستشعار البيولوجي والتفعيل. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله وقابله للتعميم للهندسة الهندسية للانظمه المستحثة كيميائيا عن طريق الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية المعروضة.

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

إن التكوير في كل مكان هو تعديل حاسم للبروتين بعد الترجمه ، وقد تورط خلل التنظيم في العديد من الأمراض البشرية. هذا البروتوكول تفاصيل كيف يمكن استخدام عرض phage لعزل المتغيرات في كل مكان الرواية التي يمكن ربط وتعديل نشاط ليجار E3 التي تتحكم في خصوصية وكفاءة وأنماط في كل مكان.

استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقليل تعديلات الحمض النووي في العاثيات باستخدام إنزيم NgTET ، مما يتيح طفرات CRISPR-Cas الفعالة والخالية من الندوب. تسهل هذه الطريقة الهندسة الوراثية للعاثيات للتطبيقات في التكنولوجيا الحيوية والعلاج بالعاثيات.

طفرات العاثية الدقيقة مع أنظمة CRISPR-Cas بمساعدة NgTET

استكشف تقنية PRANCE لتطور البروتينات باستخدام الروبوتات والتحكم التلقائي في الوقت الفعلي. تُحسّن هذه الطريقة من نجاح التطور المستمر وتُمكّن من هندسة بروتينات حساسة للبيئة.

دليل عملي للتطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات

استكشف المزيد من الفيديوهات