التحليل الكمي لاستقرار غشاء الشبكة الإندوبلازمية المرتبط بالميتوكوندريا (MAM) في نموذج عصبي لمرض الزهايمر (AD)

نحن نحاول قياس استقرار أغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا بسماكات مختلفة أو عرض فجوة ، وهو أمر مهم في تنظيم الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر. وصفتها الدراسات الحديثة على أغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا ، والتي غالبا ما تسمى MAMs ، بأنها أحد العوامل الرئيسية في بدء أمراض الأميلويد في المرحلة المبكرة من مرض الزهايمر. أدت النتائج إلى تطوير فرضية جديدة تسمى فرضية MAM ، والتي تشير إلى أن مرض الزهايمر هو مرض مرتبط بمرض MAM حصريا.

بروتوكولنا هو أول من يوفر أداة كمية لقياس استقرار MAM في الخلايا الحية ، والذي ظل يمثل تحديا حتى الآن. أكبر ميزة لبروتوكولنا هي أنه يستخدم الخاصية الديناميكية الجوهرية للميتوكوندريا لقياس التغيرات في استقرار MAM كميا عند تشديد أو تخفيف عرض فجوة MAM في الخلايا الحية.

ينصب تركيزنا في المستقبل القريب على تحسين وتوظيف أحدث تقنيات التصوير والتصوير الحرجي للخلايا الحية لفحص سلسلة من معدلات الجزيئات الاصطناعية أو الطبيعية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لمستقبلات MAMs أو مستقبلات سيجما واحدة المرتبطة ب MAM ، باستخدام منصة فحص أدوية AD المطورة مؤخرا وفهم آلية عملها.

[الراوي] لنقل الخلايا بمثبتات MAM ، استبدل خليط نخاع العظم أحادي النواة بملليلترين من وسط DMEM-F12 بدرجة حرارة الغرفة في كل بئر. اجمع بين كاشف النواة مع المكمل الأول بنسبة 4.5 إلى واحد. أضف 100 ميكرولتر من كاشف النواة إلى الخليط. ثم دوامة محلول الحمض النووي. أضف ميكروغراما إلى خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي لكل معالجة في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة مليلتر واحد لكل تعداد. بعد شفط الوسائط الموجودة من الخلايا ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 ملليلتر من PBS. استنشق PBS وأضف ملليلتر واحد من accutase مباشرة إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم اضغط برفق على جانب الطبق لإخراج الخلايا. تحت المجهر ، تحقق من أن الخلايا مرتخة وتتدفق بحرية. قم بتحييد الحشرات باستخدام 10 ملليلتر من وسط DMEM-F12 وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب نظيف سعة 15 مل. بعد ذلك ، خذ 10 ميكرولترات من الخلايا العالقة وأضفها إلى الجانب A من غرفة عد الخلايا. ثم أدخل الجانب A من الغرفة المملوءة في الفتحة الرئيسية الموجودة في الجزء الأمامي من عداد الخلية. اضغط على قياس وتسجيل عدد الخلايا لكل مليلتر. جهاز الطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق. ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من مزيج النوكليوفكتور لكل تثقيب كهربائي. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية المعلق إلى أحد الأنابيب التي تحتوي على الحمض النووي. امزج عن طريق سحب المحلول عدة مرات. ثم انقل خليط خلايا الحمض النووي إلى كوفيت كهربائي وأغلقه بالغطاء المرفق. حدد برنامج nucleofector المناسب على الجهاز. أضف على الفور ما يقرب من 500 ميكرولتر من DMEM من صفيحة مكونة من ستة آبار مملوءة مسبقا إلى الكوفيت باستخدام ماصات معقمة. تخلط برفق مرة واحدة وتنقل الخلايا الكهربائية والوسط إلى البئر المقابل. للبدء ، ضع الصفيحة المكونة من ستة آبار التي تحتوي على خلايا في غرفة المجهر واضبط تركيز المجهر حتى تصبح الخلايا مرئية. لالتقاط إشارة البروتين الفلوري الأحمر ، قم بإثارة الفلوروفور باستخدام ليزر 594 نانومتر واضبط الانبعاث على 570 إلى 640 نانومتر. بالنسبة لبروتين الفلورسنت الأخضر ، استخدم ليزر 488 نانومتر للإثارة بانبعاث 510 إلى 540 نانومتر. قم بقص منطقة المسح لتلائم المحور العصبي. ستقلل مساحة المسح الأصغر من وقت المعالجة وتبسط إنشاء التصوير الكيموغرافي. اضبط الفاصل الزمني على إطار واحد في الثانية والمدة الإجمالية على 181 ثانية. انقر فوق تشغيل لبدء العملية. تم تقليل السرعة المحورية للميتوكوندريا المرتبطة ب MAM 1X المسماة ER بنسبة 50٪ مقارنة بالميتوكوندريا المجانية و MAM 9X. كانت 26.6٪ من الميتوكوندريا MAM 1X متنقلة مقابل 53.82٪ من الميتوكوندريا الحرة و 44.79٪ من الميتوكوندريا MAM 9X. كانت الحركة الرجعية أقل للميتوكوندريا MAM 1X من الميتوكوندريا Mito-RFP والميتوكوندريا MAM 9X. كما تم تقليل الحركة الأمامية للميتوكوندريا MAM 1X مقابل Mito-RFP. كانت النسبة المئوية الثابتة للميتوكوندريا MAM 1X أعلى بكثير من الميتوكوندريا MAM 9X ، مما يعكس انخفاضا في الحركة ، في حين أن السرعة الإجمالية للميتوكوندريا MAM 1X كانت أقل بكثير من الميتوكوندريا MAM 9X.