Name: تحاليل عدوى الخلايا الظهارية مع الشيغيلة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: تعلم تحليلات عدوى الخلايا الظهارية لدراسة آليات التصاق Shigella وغزوها داخل الخلايا. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات العدوى وتطوير علاجات فعالة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشمل دعم المؤلفين قسم طب الأطفال في مستشفى ماساتشوستس العام ، وجائزة اللجنة التنفيذية لتمويل الدعم المؤقت للأبحاث (ISF) 2022A009041 ، ومنحة المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية R21AI146405 ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى منحة مركز أبحاث السمنة الغذائية في جامعة هارفارد (NORCH) 2P30DK040561-26. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

بروتوكولات لتحليل عدوى الشيغيلا في الخلايا الظهارية القولونية

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تشكل أمراض الإسهال التي تسببها مسببات الأمراض البكتيرية المعوية عبئا صحيا عالميا كبيرا. في عام 2016 ، كانت أمراض الإسهال مسؤولة عن 1.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم وكانت السبب الرئيسي الرابع للوفاة بين الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات من سن 1,2. الممرض البكتيري المعوي سلبي الجرام Shigella هو العامل المسبب لداء الشيغيلات ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم3. يسبب داء الشيغيلات معدلات اعتلال ووفيات كبيرة كل عام لدى الأطفال من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل 4,5 ، بينما ترتبط العدوى في البلدان المرتفعة الدخل بمراكز الرعاية النهارية ، والأمراض المنقولة بالأغذية ، والفاشيات المنقولة بالمياه6،7،8،9. أدى تطوير لقاحغير فعال 10 وارتفاع معدلات مقاومة مضادات الميكروبات (AMR)11,12 إلى تعقيد إدارة فاشيات الشيغيلا على نطاق واسع. تظهر بيانات مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها الحديثة أن ما يقرب من 46٪ من إصابات الشيغيلا في الولايات المتحدة أظهرت مقاومة للأدوية في عام 202013,14 ، بينما أعلنت منظمة الصحة العالمية أن الشيغيلة من مسببات الأمراض ذات الأولوية في مقاومة مضادات الميكروبات والتي تحتاج إلى علاجات جديدةبشكل عاجل 15.
تنتقل عدوى الشيغيلا بسهولة عن طريق البراز الفموي عند تناول طعام أو ماء ملوث ، أو من خلال الاتصال البشري المباشر. تطورت الشيغيلا لتصبح ممرضة فعالة ومتكيفة مع الإنسان ، مع جرعة معدية من 10-100 بكتيريا كافية للتسبب في المرض16. أثناء العبور المعوي الصغير ، تتعرض الشيغيلة لإشارات بيئية ، مثل ارتفاع درجة الحرارة والصفراء17. يؤدي اكتشاف هذه الإشارات إلى تغييرات نسخية للتعبير عن عوامل الفوعة التي تعزز قدرة البكتيريا على إصابة القولون البشري17،18،19. لا تغزو الشيغيلة ظهارة القولون من السطح القمي ، بل تنتقل عبر الطبقة الظهارية بعد الامتصاص إلى خلايا ميكروطية متخصصة تقدم المستضد (خلايا M) داخل الظهارة المرتبطة بالجريب20،21،22. بعد انتقال الخلايا ، يتم البلعمة خلايا الشيغيلة بواسطة الضامة المقيمة. تهرب الشيغيلة بسرعة من البلعمة وتؤدي إلى موت خلايا البلاعم ، مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات5،23،24. ثم تغزو الشيغيلة الخلايا الظهارية القولونية من الجانب القاعدي ، وتحلل الفجوة العصارية الكبيرة ، وتنشئ مكانا متماثلا في السيتوبلازم 5,25. تقوم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وخاصة إنترلوكين -8 (IL-8) ، بتجنيد كريات الدم البيضاء متعددة الأشكال النووية (PMNs) إلى موقع العدوى ، مما يضعف الوصلات الضيقة الظهارية ، ويمكن من تسلل البكتيريا للبطانة الظهارية إلى تفاقم العدوى القاعدية5. تدمر PMNs البطانة الظهارية المصابة لاحتواء العدوى ، مما يؤدي إلى الأعراض المميزة للزحار العصوي (الدموي)5. على الرغم من أن آليات الغزو والتكاثر داخل الخلايا قد تم توصيفها بدقة ، إلا أن الأبحاث الجديدة تظهر مفاهيم جديدة مهمة في عدوى الشيغيلا ، بما في ذلك تنظيم الفوعة أثناء عبور الجهاز الهضمي (GI)17 ، والالتزام19 ، وتحسين الوصول القاعدي الجانبي من خلال نفاذية الحاجز26 ، والنقل بدون أعراض في الأطفال الذين يعانون من سوء التغذية27.
تقتصر قدرة الشيغيلة على التسبب في مرض الإسهال على البشر والرئيسيات غير البشرية (NHP)28. تم تطوير نماذج عدوى الشيغيلا المعوية لسمك الزرد29 والفئران30 وخنازير غينيا31 والأرانب21،32،33 والخنازير34،35. ومع ذلك ، لا يمكن لأي من هذه الأنظمة النموذجية تكرار خصائص المرض التي لوحظت أثناء العدوى البشريةبدقة 36. على الرغم من إنشاء نماذج NHP لداء الشيغيلات لدراسة التسبب في الشيغيلة ، إلا أن هذه الأنظمة النموذجية مكلفة في التنفيذ وتتطلب جرعات معدية عالية بشكل مصطنع ، تصل إلى تسعة أوامر من حيث الحجم أعلى من الجرعة المعدية للبشر37،38،39،40،41،42. وبالتالي ، فإن التكيف الملحوظ للشيغيلا لعدوى المضيفين البشريين يستلزم استخدام مزارع الخلايا المشتقة من الإنسان لإعادة إنشاء نماذج ذات صلة من الناحية الفسيولوجية للاستجواب الدقيق لتسبب الشيغيلا.
هنا ، يتم وصف الإجراءات التفصيلية لقياس معدلات الالتزام بالشيغيلة وغزوها وتكرارها داخل الخلايا الظهارية القولونية HT-29. باستخدام هذه البروتوكولات الموحدة ، يمكن استجواب الآليات الجزيئية التي تؤثر بها جينات الفوعة البكتيرية والإشارات البيئية على كل خطوة من خطوات عدوى الشيغيلا لفهم علاقة التفاعل الديناميكية بين المضيف والممرض بشكل أفضل.

<table><tbody><tr><td>0.22 & مرشح m PES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>فلتر معقم من البولي إيثر سلفون لتعقيم ما يصل إلى 50 مل من</td></tr><tr><td>الوسائط أنابيب زراعة 14 مل أنابيب اختبار</td><td>البولي</td> بروبلين <td>352059</td><td>17 مم × 100 مم مع غطاء</td></tr><tr><td>50 مل أنابيب مخروطية</td> الشكل <td>Corning</td><td>430829</td><td>50 مل أنابيب طرد مركزي مخروطية القاع من مادة البولي بروبيلين مع غطاء مانع للتسرب</td></tr><tr><td>ألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبار Corning</td><td></td><td>3516</td><td>تتم معالجة الألواح من أجل التعلق الأمثل للخلايا</td></tr><tr><td>أملاح الصفراو</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>نسبة 1: 1 من الكولات إلى الديوكسيكولات</td></tr><tr><td>صبغة الكونغو الحمراء</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>صبغة ديازو أنيونية قائمة على البنزيدين ، نقاء >85٪</td></tr><tr><td>شريحة غرفة عد خلايا الكونتيسة</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>لاستخدامها مع عداد الخلايا الآلي</td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد الكونتيسة (DMSO)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D8418</td><td>كاشف عضوي عالي القطبية</td></tr><tr><td>Dulbecco s النسر المعدل المتوسط (DMEM)</td><td>يتم استكمال Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM بارتفاع نسبة الجلوكوز وبيروفات الصوديوم والجلوتاماكس ومصل الأبقار الجنينية الأحمر الفينول</td></tr><tr><td>(FBS)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>جنتاميسين</td> معقم بالحرارة <td>ومعقم سيجما-ألدريتش</td><td>G3632</td><td>تركيز المخزون هو 50 مجم / مل</td></tr><tr><td>خط خلية HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>خط خلايا سرطان الغدي. القولون والمستقيم في فيلم</td></tr><tr><td>البارافين</td> الأصلي <td>Bemis</td><td>PM999</td><td>فيلم ختم المختبر</td></tr><tr><td>أطباق بتري</td><td>FB0875713 Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>أطباق بتري للوسائط الصلبة</td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)</td> <td>10010049 Thermo Fisher Scientific</td><td></td> تركيز <td>1x ؛ درجة الحموضة 7.4</td></tr><tr><td>حدد أجار</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>خليط من السكريات المستخرجة من جدران خلايا الأعشاب البحرية الحمراء لصنع وسائط الطلاء البكتيرية</td></tr><tr><td>قوارير T75 Corning</td><td></td><td>430641U</td><td>قوارير زراعة</td></tr><tr><td>الأنسجة Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيونية مشتركة ومستحلب &nbsp ؛</td></tr><tr><td>صبغة التريبان الزرقاء</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>صبغة للكشف عن خلايا زراعة الأنسجة الميتة ؛ يمكن للخلايا الحية فقط استبعاد الصبغة</td></tr><tr><td>كاشف Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>لتفكك الخلايا لصيانة خط الخلايا وتمرير</td></tr><tr><td>مرق الصويا الترابتي (TSB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>وسائط نمو البكتيريا</td></tr></tbody></table>

تحاليل عدوى الخلايا الظهارية مع الشيغيلة

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

يسبب العامل الممرض البكتيري المعوي المتكيف مع الإنسان Shigella ملايين الإصابات كل عام ، ويخلق تأثيرات نمو طويلة الأجل بين مرضى الأطفال ، وهو سبب رئيسي لوفيات الإسهال في جميع أنحاء العالم. تسبب العدوى الإسهال المائي أو الدموي نتيجة لعبور العامل الممرض للجهاز الهضمي وإصابة الخلايا الظهارية المبطنة للقولون. مع الزيادات المذهلة في مقاومة المضادات الحيوية والنقص الحالي في اللقاحات المعتمدة ، تعد بروتوكولات البحث الموحدة ضرورية لدراسة هذا العامل الممرض الهائل. هنا ، يتم تقديم منهجيات لفحص التسبب الجزيئي للشيغيلا باستخدام التحليلات المختبرية للالتصاق البكتيري والغزو والتكاثر داخل الخلايا في الخلايا الظهارية القولونية. قبل تحليلات العدوى ، تم التحقق من النمط الظاهري للضراوة لمستعمرات الشيغيلا من خلال امتصاص صبغة الكونغو الحمراء على ألواح الآجار. يمكن أيضا اعتبار الوسائط المختبرية المكملة أثناء الزراعة البكتيرية لتقليد الظروف في الجسم الحي . ثم تستخدم الخلايا البكتيرية في بروتوكول موحد لإصابة الخلايا الظهارية القولونية في لوحات زراعة الأنسجة في تعدد ثابت من العدوى مع التكيفات لتحليل كل مرحلة من مراحل العدوى. لمقايسات الالتصاق ، يتم تحضين خلايا الشيغيلا بمستويات وسائط منخفضة لتعزيز الاتصال البكتيري بالخلايا الظهارية. لكل من مقايسات الغزو والتكرار داخل الخلايا ، يتم تطبيق الجنتاميسين لفترات زمنية مختلفة للقضاء على البكتيريا خارج الخلية وتمكين تقييم الغزو و / أو القياس الكمي لمعدلات النسخ المتماثل داخل الخلايا. تعدد جميع بروتوكولات العدوى البكتيريا الملتصقة و / أو الغازية و / أو داخل الخلايا عن طريق التخفيف المتسلسل لمحللات الخلايا الظهارية المصابة وطلاء وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية المتعلقة بإصابة التتر على ألواح أجار الكونغو الحمراء. تتيح هذه البروتوكولات معا توصيفا ومقارنات مستقلة لكل مرحلة من مراحل عدوى الشيغيلة للخلايا الظهارية لدراسة هذا العامل الممرض بنجاح.

تم إجراء فحوصات الالتصاق والغزو والتكرار داخل الخلايا بمقارنة النوع البري S. flexneri 2457T (WT) إلى S. flexneri ΔVF (ΔVF) ، وهو متحولة يفترض أنها تنظم ضراوة الشيغيلا بشكل سلبي. وبما أن الشيغيلا تستخدم الأملاح الصفراوية كإشارة لتنظيم الفوعة17،18،47، فقد أجريت التجارب بعد الاستزراع الفرعي البكتيري في أوساط مكتب تقييس الاتصالات وكذلك الأملاح الصفراوية بنسبة 0,4٪ (وزن/حجم)18. يعمل التعرض لأملاح الصفراء أثناء خطوة الاستزراع الفرعي كمعالجة مسبقة لتكرار العبور المعوي الدقيق قبل عدوى القولون17،18،47. يحلل الشكل 1 تأثير طفرة ΔVF على قدرة S. flexneri على الالتصاق بالخلايا الظهارية القولونية HT-29. يتم رسم النسبة المئوية للالتزام على المحور ص وتمثل نسبة البكتيريا المستعادة بعد تحلل HT-29 الموحد إلى عدد البكتيريا المدخلة. وكما هو متوقع، شهدت كل من سلالات S. flexneri WT و ΔVF زيادة كبيرة في الالتزام عند الاستزراع الفرعي مع مكملات الأملاح الصفراوية مقارنة ب TSB بدون مكملات الأملاح الصفراوية18. ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق في الالتزام بخلايا HT-29 بين سلالات WT و ΔVF الطافرة داخل كل حالة من حالات الثقافة الفرعية. تشير هذه البيانات إلى أن طفرة ΔVF ليس لها أي تأثير على قدرة S. flexneri على الالتصاق بالخلايا الظهارية HT-29 مع أو بدون الأملاح الصفراوية قبل المعالجة.
في الشكل 2 ، تم تحليل تأثير طفرة ΔVF على قدرة S. flexneri على الغزو (الشكل 2A) والتكاثر (الشكل 2B) داخل الخلايا الظهارية القولونية HT-29 مع أو بدون أملاح الصفراء قبل المعالجة. يتم رسم النسبة المئوية للاسترداد على المحور ص وتمثل نسبة الخلايا البكتيرية المستعادة بعد تحلل الخلايا HT-29 الموحد إلى عدد البكتيريا المدخلة. في الشكل 2 أ ، كانت هناك زيادة كبيرة متوقعة في قدرة WT S. flexneri 2457T على غزو خلايا HT-29 بعد التعرض المسبق للأملاح الصفراوية48 ، بينما أظهر متحولة S. flexneri ΔVF زيادة أقل في الغزو بعد التعرض المسبق للأملاح الصفراوية مقارنة بسلالة WT. وقد زاد طافر ΔVF من معدلات غزو خلايا HT-29 مقارنة ب WT المستزرع في TSB ، ولكن كان لديه معدلات غزو مماثلة ل WT عند الاستزراع الفرعي في TSB المكمل بالأملاح الصفراوية (الشكل 2A). تشير هذه النتائج إلى أن طفرة ΔVF تعزز قدرة S. flexneri على غزو خلايا HT-29 ، مما يقلل من تأثير الأملاح الصفراوية قبل التعرض على الرغم من أن قدرة غزو متحولة ΔVF زادت أكثر بعد الثقافة الفرعية للأملاح الصفراوية.
بشكل عام ، تم استرداد بكتيريا أكثر بمقدار 10 أضعاف بعد الحضانة الليلية (الشكل 2 ب) مقارنة بالحضانة لمدة 90 دقيقة (الشكل 2 أ) ، مما يوضح الاختلافات في مراقبة النمو داخل الخلايا مقابل الغزو ، على التوالي. عندما تم تحضين خلايا HT-29 المصابة لمدة 18 ساعة للسماح بتكرار البكتيريا داخل الخلايا (الشكل 2B) ، انخفض تأثير الأملاح الصفراوية قبل المعالجة لكل من سلالات WT و ΔVF . ومع ذلك ، كان التأثير المنخفض للأملاح الصفراوية قبل المعالجة أثناء النسخ المتماثل داخل الخلايا أكثر دراماتيكية بالنسبة لمتحولة ΔVF . نظرا لأن الزيادة في التكاثر داخل الخلايا لكلا السلالتين عند التعرض المسبق للأملاح الصفراوية كانت أصغر من الزيادة في معدلات الغزو في نفس الظروف ، فإننا نفترض أن الأملاح الصفراوية لها تأثير أكبر على الخطوات المبكرة في التسبب في S. flexneri . أظهر متحور ΔVF زيادة في النسبة المئوية للاسترداد من التكاثر الليلي داخل خلايا HT-29 مقارنة ب WT (الشكل 2B) بعد ظروف الاستزراع الفرعي. ومع ذلك ، كانت النسبة المئوية لاسترداد طفرة ΔVF متشابهة بغض النظر عن الأملاح الصفراوية قبل التعرض. تشير اتجاهات البيانات هذه إلى أن متحولة ΔVF تتكاثر بشكل أكثر كفاءة داخل خلايا HT-29 مقارنة ب WT ، وأن التعرض المسبق للأملاح الصفراوية لا يؤثر على قدرة طفرة ΔVF على التكاثر داخل الخلايا ، كما لوحظ ل WT (الشكل 2B). نظرا لأن الفرق بين سلالات الطفرة و WT في حالة ما قبل التعرض للأملاح الصفراوية لم يلاحظ خلال اختبار الغزو لمدة 90 دقيقة ، فإننا نفترض أن المنتج المشفر بواسطة جين VF المحذوف قد ينظم أيضا تكرار S. flexneri داخل خلايا HT-29. ويوضح كلا التحليلين مجتمعين أن متحور ΔVF أكثر ضراوة بالنسبة إلى WT، مما يشير إلى أن منتج جين VF هو منظم سلبي لضراوة S. flexneri .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> الشكل 1: التصاق أملاح الصفراء قبل التعرض الناجم عن التصاق S. flexneri بخلايا HT-29. تم استزراع الخلايا الطافرة S. flexneri 2457T WT و ΔVF إما في TSB أو TSB مكملة بنسبة 0.4٪ (وزن / حجم) من الأملاح الصفراوية (TSB + BS) الوسط. ثم تم تطبيق البكتيريا على خلايا HT-29 عند تعدد العدوى (MOI) من 100 وحضنت لمدة 3 ساعات لفحص الالتزام. بعد الحضانة ، تم غسل خلايا HT-29 المصابة وتحليلها ، وتم طلاء التخفيفات التسلسلية للبكتيريا المستعادة لتعداد وحدات تكوين المستعمرات لكل مل (CFU / mL). يتم رسم عدد البكتيريا الملتصقة بالنسبة إلى عيار البكتيريا المدخلة لتحديد نسبة الالتزام. تمثل البيانات نسخة بيولوجية واحدة مع ثلاث مكررات تقنية (نقاط فردية). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال اختبار t للطالب (* p &lt; 0.05 ؛ ***p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> الشكل 2: زاد التعرض لأملاح الصفراء قبل التعرض لغزو WT S. flexneri والتكاثر داخل الخلايا. تم استزراع الخلايا الطافرة S. flexneri 2457T WT و ΔVF إما في TSB أو TSB مكملة بأملاح صفراوية (TSB + BS) في الوسط. ثم تم تطبيق البكتيريا على خلايا HT-29 عند MOI من 100 ، والطرد المركزي على الخلايا ، وحضنت عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 لمدة 45 دقيقة. تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتم تحليل البكتيريا خارج الخلية عن طريق إضافة الجنتاميسين إلى DMEM لاستعادة البكتيريا داخل الخلايا حصريا. بعد 90 دقيقة (A ، الغزو البكتيري) أو 18 ساعة (B ، التكاثر داخل الخلايا) ، تم غسل خلايا HT-29 المصابة وتحليلها ، وتم طلاء التخفيفات التسلسلية للبكتيريا المستعادة لتعداد وحدات تكوين المستعمرة لكل مل (CFU / mL). يتم رسم عدد البكتيريا داخل الخلايا بالنسبة إلى التتر البكتيري المدخلات لتحديد النسبة المئوية للاسترداد. تمثل البيانات نسخة بيولوجية واحدة ، لكل منها ثلاث نسخ تقنية (نقاط فردية). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال اختبار t للطالب (* p &lt; 0.05). يرجى ملاحظة الاختلافات في مقاييس المحور ص بين اللوحتين (أ) و (ب). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

يصف البروتوكول الحالي مقايسات العدوى لاستجواب الالتزام بالشيغيلا والغزو والتكاثر داخل الخلايا باستخدام خطوط الخلايا الظهارية في المختبر .

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

الشيغيلا هي أحد مسببات الأمراض العالمية الهامة التي تسبب معدلات عدوى مدمرة كل عام. تصيب الشيغيلة الجهاز الهضمي لتسبب الإسهال أو الزحار. يهدف بحثنا إلى تحسين فهمنا للعدوى للمساعدة في تطوير علاجات أكثر فعالية مثل اللقاحات وغيرها من المنتجات المضادة للميكروبات.أولا ، تسمح لنا النماذج الحيوانية وتقنيات زراعة الأنسجة الناشئة بفهم فسيولوجيا عدوى الشيغيلا بشكل أفضل وإعادة إنتاج تعقيد الجهاز الهضمي البشري بأمانة. ثانيا ، ساعد توصيف عزلات الشيغيلا السريرية على التقاط تنوع هذا الجنس ، وتحديد جينات الفوعة المهمة ، وتحسين فهمنا للعدوى. لقد استخدمنا إشارات الجهاز الهضمي مثل الأملاح الصفراوية والجلوكوز لفهم كيفية بقاء الشيغيلة على قيد الحياة في الأمعاء الدقيقة وتنظيم التعبير الجيني للضراوة للعدوى في الأمعاء الغليظة.لقد أثبتنا كيف تقاوم الشيغيلة الأملاح الصفراوية وأظهرنا أن الشيغيلا تنتج بروتينات الالتصاق للمساعدة في بدء الاتصال بالخلايا الظهارية لبدء العدوى. تم تصميم هذه البروتوكولات للنظر في الجوانب الرئيسية للعدوى الظهارية مثل الالتزام والغزو والبقاء داخل الخلايا للشيغيلة. نحن ننفذ هذه البروتوكولات باستخدام خط خلايا ظهارية قياسي ، ولكننا قمنا أيضا بتكييف الأساليب لنماذج GI البشرية المتطورة المتوفرة الآن.تنظر هذه البروتوكولات في كل مرحلة من مراحل العدوى بشكل مستقل ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم الخطوات الرئيسية في عدوى الشيغيلا. كما أنها تسلط الضوء على أن التحليلات المشتركة يمكن أن تسهل فهما أكبر لعدوى الشيغيلا على المستوى الشامل.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: فونيش، ب. وآخرون، تحليل التألق المناعي لتكوين حبيبات الإجهاد بعد التحدي البكتيري لخلايا الثدييات. J. Vis. Exp. (2017)يظهر هذا الفيديو إصابة الخلايا الظهارية بالبكتيريا الممرضة شيجيلا فليكسنيري والاستجابة الخلوية الناتجة عن المضيف. تعطل بروتينات المؤثر البكتيري ترجمة المضيف، مما يؤدي إلى تكوين عضيات بدون غشاء تسمى حبيبات الإجهاد، والتي تعكس استجابة الخلية التكيفية للعدوى.

تكوين حبيبات الإجهاد أثناء عدوى شيجيلا في خلايا ظهارية سرطانية

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

يوضح هذا الفيديو تقنية للكشف عن استجابة أيونات الكالسيوم المحلية والعالمية عند عدوى الشيغيلا للخلايا الظهارية البشرية. تغزو الشيغيلا الخلايا المضيفة وتطلق مؤثرات الغزو ، مما يؤثر على مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. تتم دراسة سعة وتواتر الكالسيوم العصاري الخلوي المحلي والعالمي باستخدام مؤشر الفلورسنت.

تقنية تصوير لدراسة استجابة الكالسيوم في الخلايا المصابة بالبكتيريا

نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل...

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

لمواجهة نشر الممرض، الخلايا المضيفة إعادة تنظيم الهيكل الخلوي لتجزئة البكتيريا وحمل الالتهام الذاتي. يتم تحديد العدوى عن طريق الشيجلا الخلايا زراعة الأنسجة، المضيف والمحددات الكامنة وراء هذه العملية الممرض وتتميز. باستخدام نماذج الزرد العدوى الشيجلا، يتم التحقيق في دور الجزيئات والآليات التي اكتشفت في الجسم الحي.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

نقدم هنا، البروتوكولات تصور ردود الكالسيوم (Ca2 +) أثارت هيلا الخلايا المصابة دوسنتاريا. عن طريق تحسين معلمات العدوى البكتيرية والتصوير مع Ca2 + نيون تحقيقات، تتميز شاذة العالمية والمحلية Ca2 + إشارات الناجم عن البكتيريا على نطاق كبير من حركية العدوى.

التصوير Ca2 + الردود خلال العدوى دوسنتاريا الخلايا الظهارية

الخلايا M في ظهارة جريب المرتبطة المتخصصة التي تغطي بقع باير لتلعب دورا هاما لالترصد المناعي المخاطي في الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية. نحن هنا وصف طريقة لتقييم من قبل خلايا جرثومية transcytosis...

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

وقد ثبت أن الأجنة الزرد شفاف المضيفين نموذجا مفيدا لتصور ودراسة التفاعلات وظيفيا بين الخلايا المناعية الفطرية ومسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا،...

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

وصفنا عزل الخلايا الأولية السريع للنوع الثاني الفئران السنخية الظهارية (وادي) عن طريق الانتقاء السلبي تدفق cytometric. هذه تظهر قابلية عالية وادي والنقاء ومناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية بشأن دورها في أمراض الجهاز التنفسي مثل أمراض المناعة الذاتية أو المعدية.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

عدوى الإنسان عن طريق المتحولة الحالة للنسج يؤدي إلى الأميبية، سببا رئيسيا من أسباب الإسهال في البلدان الاستوائية. وبدأت العدوى عن طريق التفاعلات الممرض مع الخلايا الظهارية في الأمعاء، مما أدى إلى افتتاح اتصالات خلية خلية، وبالتالي الإسهال، يليه في بعض الأحيان عن طريق العدوى الكبد. توفر هذه المقالة نموذج لتقييم مبكر التفاعلات المضيف الممرض لتحسين فهمنا للالأميبية المرضية.

تحليل الأضرار الظهارية التي تنتجها<em&gt; المتحولة الحالة للنسج</em&gt; عدوى

تعلم تحليلات عدوى الخلايا الظهارية لدراسة آليات التصاق Shigella وغزوها داخل الخلايا. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات العدوى وتطوير علاجات فعالة.

تحاليل عدوى الخلايا الظهارية مع الشيغيلة

استكشف المزيد من الفيديوهات