تحضير نموذج الفئران لالتهاب البنكرياس الحاد الوخيم عن طريق مزيج من حقن القيرولين وعديس السكاريد الشحمي داخل الصفاق

يصعب علاج التهاب البنكرياس الحاد الوخيم بسبب ارتفاع معدلات الوفيات باستخدام النماذج الحيوانية ، وتحديدا الفئران ذات الخلفية المختارة C57BL / 6J. نحن نحقق في SAP كمرضية لتحديد الأهداف العلاجية وتطوير علاجات جديدة ، وتوفير طريقة polymice في بحث SAP.

كشف هذا البحث عن التعبير العالي عن جينات HMGB1 التي أصيبت بالتهاب البنكرياس ، مما يشير إلى ارتباطه بالحجر الالتهابي لالتهاب البنكرياس الحاد الوخيم. يتضمن بروتوكولنا Caerulein للحث على تقلص المرارة وتعطيل الصيام عند الفئران ، مما يؤدي إلى تلف أنسجة البنكرياس عن طريق منع إفراز السائل الهضمي. جنبا إلى جنب مع حقن LPS ، تسببنا في التهاب البنكرياس الحاد مع فشل الأعضاء في الفئران. هذا النهج غير جراحي وسهل التنفيذ بدورات قصيرة وقابلية تكرار عالية.

[متظاهر] للبدء ، قم بقياس وتسجيل وزن الماوس التجريبي. لحقن Caerulein داخل الصفاق ، أمسك بالماوس مع توجيه البطن لأعلى والرأس في وضع أقل من الذيل. أمسك المحقنة في اليد اليمنى وأدخل الإبرة في الجلد تحت الجلد على الجانب الأيسر من الخط الأبيض للبطن. حرك الإبرة للأمام حوالي ثلاثة إلى خمسة ملليمترات وأدخلها في تجويف البطن بزاوية 45 درجة. حافظ على الإبرة ثابتة وحقن Caerulein ببطء. اسحب الإبرة للخارج ، ثم قم بتدليك موقع الحقن برفق واضغط عليه بقطعة قطن معقمة لنشر الدواء بالكامل في تجويف البطن. بعد 12 ساعة من الحقن ، ضع الماوس في منتصف الشبكة في الصندوق التجريبي متجها بعيدا عن المجري. قم بتشغيل برنامج تتبع الفيديو وقم بإعداد المراقبة لأربعة مجالات رؤية متزامنة. حدد طول وعرض الكائن التجريبي الذي يمكن أن يتحرك داخل الصندوق في شاشة المراقبة في الوقت الفعلي. سجل نشاط الماوس لمدة 15 دقيقة. أظهرت التغييرات العيانية التي تم قياسها في نموذج الفئران لإصابة البنكرياس خلال الدورات الخمس أن الفئران في المجموعة 5 لإصابات البنكرياس حافظت على مستوى منخفض من مسافة الحركة في غضون ثلاث دقائق ، بينما زادت نسبة الجمود في غضون ثلاث دقائق مع كل دورة لاحقة. أظهرت مجموعة إصابات البنكرياس 5 أصغر مسافة حركة إجمالية مقارنة بالمجموعات التجريبية الأخرى ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية. باستثناء المجموعة 1 لإصابة البنكرياس والضابطة، أظهرت جميع المجموعات نموا سلبيا في الوزن في القيمة D، حيث أظهرت مجموعة إصابة البنكرياس 5 أكبر تغيير. أشار تحليل معدل البقاء على قيد الحياة إلى معدل وفيات 80٪ في المجموعة 5 من إصابات البنكرياس بحلول اليوم الخامس ، على عكس المجموعات الأخرى التي لم تظهر فرقا كبيرا عن المجموعة الضابطة. بعد 36 ساعة من الحقن داخل الصفاق من Caerulein ، قم بالقتل الرحيم وتأمين الفأر في وضع ضعيف على صفيحة رغوية. قم بعمل شق متوسط في البطن واقلب أنبوب الأمعاء الدقيقة إلى اليمين لكشف البنكرياس. افصل الاثني عشر وقناة البواب. حدد موقع الأمعاء الدقيقة أسفل البنكرياس، ثم حرر أنسجة البنكرياس بالكامل على طول القناة المعوية. باستخدام ملقط بدون أسنان ، قم بتثبيت الطحال واسحبه برفق لأعلى. تشريح أنسجة الرباط البنكرياس الخلفي بحدة حتى رأس البنكرياس. ثم افصل القناة الصفراوية والأوعية الدموية. قم بإزالة أنسجة البنكرياس من تجويف البطن واتركها على رطوبة السطح بورق ماص. قياس وتسجيل وزن أنسجة البنكرياس. بعد تحضير أقسام البارافين ، قم بإزالة الشمع من أنسجة البنكرياس مرتين في الزيلين لمدة خمس دقائق لكل منهما. عالج كل قسم ب 100 ميكرولتر من البروتيناز K واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف الكمية المطلوبة من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ إلى الأنسجة واحتضن لمدة 20 دقيقة للتسلل إليها بالكامل. قم بتغطية مساحة العينة بأكملها ب 50 ميكرولتر من عازلة التوازن واحتضانها لمدة 10 دقائق. ثم أضف 56 ميكرولترا من مخزن حضانة TDT إلى كل عينة من الأنسجة واحتضنه لمدة ساعة واحدة. اغسل أقسام الأنسجة أربع مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها قبل احتضانها لمدة 30 دقيقة في 100 ميكرولتر من محلول تفاعل Streptavidin-HRP. لتلطيخ DAB ، أضف 50 ميكرولتر من DAB إلى كل قسم من أقسام الأنسجة. اغمر الأقسام في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة ثلاث إلى خمس دقائق قبل شطفها بالماء النقي. جفف العينات بأربع جولات من الإيثانول اللامائي الطازج لمدة خمس دقائق لكل منها. إجراء فحص نسيجي تحت مجهر الضوء الأبيض. كشف تلطيخ TUNEL على أنسجة البنكرياس للفئران عن زيادة في النخر الخلوي في مجموعة إصابات البنكرياس 5 ، مع قيم مقياس رمادي أعلى بكثير ومعدلات نخر إيجابية مقارنة بالمجموعات الأخرى. قام النشاف المناعي للبروتين بتقييم تعبير Caspase-3 ، وهو علامة على النخر الخلوي ، وأظهر ارتفاعا كبيرا في أنسجة مجموعة إصابة البنكرياس 5. أشار قياس التدفق الخلوي لمعلقات خلايا البنكرياس ، المسمى ب Nexin 5 fit CPI ، إلى ارتفاع معدل موت الخلايا بشكل ملحوظ في مجموعة إصابات البنكرياس 5 مقارنة بالآخرين ، مع دلالة إحصائية.