عزل النوى من الأنسجة الدهنية العضلية البشرية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى في اتجاه مجرى النهر
مايو 3, 2024
بيولوجيا الأنسجة الدهنية العضلية (IMAT) غير مستكشفة إلى حد كبير بسبب محدودية إمكانية الوصول إلى الأنسجة البشرية. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل النوى وإعداد مكتبة IMAT البشري المجمد لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى لتحديد التركيب الخلوي لهذا المستودع الدهني الفريد.
تحاول مجموعتنا البحثية فهم تكوين الخلية وملامح النسخ الخاصة بالخلية للأنسجة الدهنية العضلية أو IMAT في البشر. IMAT هو في الواقع مستودع دهني خارج الرحم يقيم بين ألياف العضلات وحولها. تمكن التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي من تحديد حجم IMAT وأظهر مؤخرا أنه يزداد مع تقدم العمر ومؤشر كتلة الجسم ، ويرتبط أيضا بالأمراض التنكسية العضلية.
أظهرت الدراسات الإفرازية في المختبر مؤخرا أن البروتينات المفرزة IMAT لديها القدرة على التأثير على حساسية الأنسولين ، والملامح الالتهابية ، وكذلك تعبيرات البروتين المقلص في العضلات الهيكلية البشرية. إن الكمية المحدودة من أنسجة IMAT التي تم جمعها أثناء الخزعات والطبيعة المحملة بالدهون للخلايا الشحمية تجعل هذا النسيج غير متوافق مع هضم الأنسجة وخلية واحدة RNA-Seq. لذلك ، أردنا تطوير بروتوكول يقوم بعزل النوى على كميات صغيرة من الأنسجة التي يمكن استخدامها بعد ذلك في RNA-Seq أحادي النواة في المصب.
سيمكن هذا البروتوكول الباحثين من تحديد التغيرات النسخية التركيبية والخاصة بالخلية التي تحدث في IMAT في حالات أمراض التمثيل الغذائي المختلفة واستجابة للتدخلات. نأمل أن تكون هذه المعلومات حاسمة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للمساعدة في التخفيف من أمراض التمثيل الغذائي إما عن طريق استهداف IMAT مباشرة أو عواملها المفرزة. يفتقر المجال بشدة إلى بيانات حول بيولوجيا IMAT ، وأصوله الخلوية ، والتواصل مع الخلايا الأخرى ، المقيمة داخل وخارج IMAT ، بالإضافة إلى استجاباته الجزيئية لتدخلات نمط الحياة ، مثل النظام الغذائي والتمارين الرياضية أو العلاج الدوائي.
كل هذه أسئلة بحثية رئيسية لمجموعتنا.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التركيب الخلوي والملفات النسخية المحددة للأنسجة الدهنية بين العضلات (IMAT) لدى البشر، وهي منطقة أقل استكشافاً نظراً لمحدودية إمكانية الوصول إلى الأنسجة. يتم تقديم بروتوكول مفصل لعزل النواة وتحضير المكتبة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي للنواة المفردة (single nuclei RNA sequencing) لتسهيل تحديد المكونات الخلوية ضمن هذا المستودع الدهني الفريد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الأنسجة الدهنية بين العضلات (IMAT)
- التركيب والوظيفة الخلوية
- التأثير على الأمراض الأيضية
خلفية علمية
- تعد الأنسجة الدهنية الموجودة بين العضلات (IMAT) مستودعًا دهنيًا منتبذًا يقع بين الألياف العضلية.
- يزداد حجم هذه الأنسجة مع تقدم العمر وزيادة مؤشر كتلة الجسم (BMI)، ويرتبط ذلك بأمراض تنكس العضلات.
- تؤثر البروتينات التي تفرزها الأنسجة الدهنية الموجودة بين العضلات (IMAT) على حساسية الأنسولين والالتهاب في العضلات الهيكلية.
الطرق المستخدمة
- عزل النوى من عينات صغيرة من أنسجة IMAT البشرية
- تسلسل الحمض النووي الريبي للنوى المفردة
- تطوير بروتوكول للتعامل مع الأنسجة الدهنية الغنية بالليبيدات
النتائج الرئيسية
- تطوير بروتوكول يُمكّن الباحثين من تحليل الترانسكريبتوميكس النوعية للخلايا في النسيج الدهني داخل العضلات (IMAT).
- تسهيل تحديد التغيرات الخلوية في حالات الأمراض الأيضية والتدخلات العلاجية.
- تحسين فهم دور النسيج الدهني داخل العضلات (IMAT) في الصحة الأيضية.
الاستنتاجات
- تقدم الدراسة رؤى قيمة حول بيولوجيا الأنسجة الدهنية العضلية البينية (IMAT).
- قد توجه النتائج استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف الأنسجة الدهنية العضلية البينية (IMAT) في الأمراض الأيضية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعالج تسلسل الحمض النووي الريبي للنوى المفردة (Single-nuclei RNA sequencing) للأنسجة الدهنية بين العضلات (IMAT) البشرية فجوة حرجة في فهم التركيب الخلوي والحالات النسخية النوعية للمستودعات الدهنية ذات الصلة بالأمراض الأيضية والأمراض التنكسية العضلية. يتيح هذا البروتوكول إجراء تحليل دقيق وعالي الدقة من مواد خزعة محدودة، مما يدعم الثقة التنبؤية في الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف لمحافظ الأمراض الأيضية. كما يعزز هذا النهج من تقليل المخاطر الآلية عند تقاطع بيولوجيا الدهون والعضلات، مما يوجه الأبحاث الانتقالية وتطوير الاستراتيجيات العلاجية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكّن من استقصاء التباين الخلوي والبرامج النسخية النوعية لـ IMAT.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال الكشف عن بصمات التعبير الجيني النوعية لأنواع الخلايا.
- يسهل عملية تقليل المخاطر الميكانيكية لأهداف أمراض التمثيل الغذائي والعضلات.
- يوفر بيانات أساسية لتحديد أولويات استراتيجيات التدخل النوعية لكل مستودع دهني.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز معلقات نووية معتمدة مناسبة لسير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي للنواة الواحدة (single-nuclei RNA-seq) عالي الإنتاجية.
- يوحد معالجة العينات المأخوذة من خزعات الأنسجة البشرية المحدودة والغنية بالدهون.
- يتيح الكشف القابل للتكرار عن المجموعات الخلوية النادرة ومنخفضة الوفرة.
- يدعم قراءات ترانسكريبتومية كمية لتقييم المركبات في المراحل اللاحقة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يربط الملفات الخلوية لـ IMAT بالأنماط الظاهرية الأيضية والعضلية ذات الصلة بالمرض.
- يتيح الاستمرارية من مرحلة اكتشاف الأنسجة البشرية إلى مرحلة التحقق من صحة النماذج قبل السريرية.
- يدعم تحديد المؤشرات الحيوية الانتقالية المرتبطة ببيولوجيا IMAT.
- يوجه التقدم المعدل حسب المخاطر للبرامج العلاجية التي تستهدف المستودعات.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يدمج بروتوكول عزل النوى وتسلسلها هذا في المسار الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية لأبحاث الأمراض الأيضية والعضلية، مما يتيح التحقق القوي من الأهداف وضمان الاستمرارية الترجمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتركيب الخلوي لـ IMAT وتأثير السيكريتوم على الأنسجة العضلية.
- الفحص: يوفر تحضيرات نووية معيارية وقابلة للتكرار لإجراء تحاليل ترانسكريبتومية قابلة للتوسع.
- التحليلات: يوفر بيانات كمية من تسلسل RNA لنواة واحدة (single-nuclei RNA-seq) لإجراء تحليل مقارن عبر الحالات المرضية والتدخلات العلاجية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط النتائج المستخلصة من الأنسجة البشرية بتطوير النماذج قبل السريرية واكتشاف المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس بروتوكولاً قابلاً لإعادة الاستخدام لتوصيف مستودعات دهنية أخرى صعبة أو عينات خزعة محدودة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف المتعلقة بـ IMAT والفهم الآلي.
- القيمة التشغيلية: توحد عملية عزل النوى من الأنسجة البشرية المحدودة والغنية بالدهون لضمان تحليل لاحق قابل للتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات مدروسة بشأن الاستمرار أو التوقف في البرامج العلاجية التي تستهدف المستودعات، وتقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأصول أمراض التمثيل الغذائي والعضلات بناءً على بيانات الأنسجة البشرية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الأنسجة، وعزل النوى، وتحضير مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي للنواة الواحدة (single-nuclei RNA-seq).
- يتطلب الوصول إلى أجهزة متخصصة لعد النوى والتسلسل القائم على القطيرات.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص معالجة العينات وسير عمل تحليل البيانات.
- قد يتطلب التكيف مع مستودعات دهنية أخرى أو أنواع أنسجة ذات محتوى دهني مختلف.
- يتقيد بكمية وجودة مادة الخزعة البشرية المتاحة للتحليل.
