تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا الظهارية الصعترية للفأر وتلوين الجزيئات داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي

الخلايا التائية هي خلايا مناعية تحمي أجسامنا من الأمراض المعدية والسرطان. الغدة الصعترية هي عضو ينتج الخلايا التائية ويختار الخلايا التائية النامية وفقا للمكونات الذاتية للجسم. نحن مهتمون بكيفية إنتاج الغدة الصعترية واختيارها للخلايا التائية التي تحمي أجسامنا ومع ذلك تتحمل الجسم.

ساهم مختبرنا في تحليل الخلايا الظهارية الصعترية ، والتي لها دور رئيسي في إنتاج واختيار الخلايا التائية في الغدة الصعترية. ساعدنا تحليل مستوى الخلية المفردة للخلايا الظهارية الصعترية على فهم الآلية الجزيئية لتطور الخلايا التائية واختيارها بشكل أفضل. تتنوع الخلايا الظهارية الصعترية بشكل كبير مع هياكل معقدة ، مما يجعل عزلتها صعبة.

التكنولوجيا الحالية لعزل المعلقات أحادية الخلية محدودة وتحتاج إلى تحسين. ومع ذلك ، فإن عزل الخلية المفردة للخلايا الظهارية الصعترية يعزز فهمنا للآلات الجزيئية المشاركة في تطورها ووظيفتها. نأمل أن تساهم دراستنا في فهم توليد الخلايا المناعية وتجديدها.

نعتقد أنه سيكون بمثابة حجر زاوية مهم للنهوض بصحة الإنسان. بعد حصاد الغدة الصعترية من الفأر ، ضعه في خمسة ملليلتر من RPMI 1640 يحتوي على 10 ملليمولار HEPES في طبق بلاستيكي 60 ملم على الجليد. تحت مجهر تشريح ، استخدم ملاقط منحنية ذات أطراف رفيعة لإزالة أنسجة الدم وغير الغدة الصعترية والدهنية.

قطع الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة بمقص تشريح. انقل قطع الغدة الصعترية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من ملليغرام واحد لكل مليلتر كولاجيناز وديسباز ، ووحدة واحدة لكل مليلتر DNase في RPMI 1640 تحتوي على 2٪ FBS. احتضان الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم امزج المعلق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة ثلاثة ملليلتر ، واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة تقريبا أو حتى لا ترى شظايا الأنسجة. أضف خمسة ملليلتر من خمسة ملليمولار EDTA في HBSS الذي يحتوي على 1٪ FBS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرون في أنبوب جديد سعة 50 مل.

قم بالطرد المركزي للتعليق عند 350G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من المخزن المؤقت FACS. قم بتخزين الخلايا على الجليد وتحديد أرقام الخلايا باستخدام عداد الخلايا. بعد حصاد الغدة الصعترية من فأر حديثي الولادة ، استخدم ملاقط منحنية ذات أطراف رفيعة لإزالة الدم والأنسجة غير الصعترية والدهنية.

انقل الغدة الصعترية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 0.2 ملليلتر من RPMI 1640 يحتوي على 10 ملليمولر HEPES. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر، تخلص من الوسيط، ثم أضف 0.5 ملليلتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجيناز والديسباز ووحدة واحدة لكل مليلتر من Dnase في RPMI 1640 تحتوي على 2٪ FBS. احتضان الأنبوب في كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية.

أثناء الحضانة ، اخلطي برفق باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد. بعد 10 دقائق ، أضف 0.5 ملليلتر من خمسة ملليمولار EDTA في HBSS الذي يحتوي على 1٪ FBS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.

أضف تسعة ملليلتر من RPMI 1640 يحتوي على 10 مللي مولار HEPES إلى الأنبوب. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق الحبيبات في واحد إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتخزين الخلايا على الجليد وتحديد أرقام الخلايا باستخدام عداد الخلايا.

للبدء ، أضف 16 في 10 إلى قوة 6 خلايا غدة صعترية للفأر حديثي الولادة أو بعد الولادة في أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ميكرولتر من تركيز العمل للجسم المضاد أحادي النسيلة لمستقبلات FC المضادة في المخزن المؤقت FACS.

احتضان الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. أضف 40 ميكرولترا لكل من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل CD45 ، والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل EpCAM ، والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل Ly-51 ، و UEA-1 في المخزن المؤقت FACS. امزج محتوى الأنبوب واحتضنه عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.

بعد الحضانة ، أضف ملليلترين من مخزن FACS. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق الحبيبات في ميكرولتر واحد من محلول Ghost Dye violet 510. امزج محتوى الأنبوب واحتضنه عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

أضف الآن ملليلترين من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية قبل تثبيت الخلايا بمليلتر واحد من 2٪ ألدهيد بارافورم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 3.5 مل من PBS إلى الأنبوب. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 700 جم لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية ونفخر الخلايا بملليلتر واحد من التثبيت داخل الخلايا والمخزن المؤقت للنفاذية.

امزج محتوى الأنبوب واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية وأضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للنفاذية. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للتعليق ، قبل إضافة 100 ميكرولتر من تركيزات العمل من الأجسام المضادة المضادة للبيتا 5t أو الجسم المضاد ل CCL21.

احتضن لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للنفاذية وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 700 جم لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. أضف الآن 100 ميكرولتر من تركيزات العمل من IgG المضادة للأرانب واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد إضافة المخزن المؤقت للنفاذية ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS واخلطها جيدا. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 60 ميكرون قبل تحليل التدفق الخلوي.

أظهرت ملامح قياس التدفق الخلوي لخلايا الغدة الصعترية المهضومة من الفئران البالغة من العمر صفر يوم والفئران البالغة من العمر أسبوعين أن أكثر من 90٪ من إشارات الجسيمات تمثل خلايا قابلة للحياة. تم تمثيل إشارات الفلورسنت للخلايا القابلة للحياة بواسطة CD45 و EpCAM. خلال مراحل حديثي الولادة ، كانت cTECs أكثر تواترا من mTECs ، ولكن بعد الولادة ، سيطرت mTECs بسبب انخفاض كفاءة تحرير cTEC.

يسمح تثبيت الخلايا ونفاذيتها باكتشاف الجزيئات داخل الخلايا داخل الخلايا داخل الخلايا TECs. تم اكتشاف تعبير Beta5t في غالبية cTECs ، ولكن ليس في mTECs. تم اكتشاف CCL21 في جزء بسيط من mTECs ولكن ليس في cTECs.

وبالمقارنة ، تم التعبير عن الهواء في مجموعة سكانية فرعية من mTECs.