هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة
نوفمبر 29, 2024
يصف هذا البروتوكول الخطوات الأساسية لإجراء حملات اختيار عرض سطح الخميرة لإثراء متغيرات البروتين المرتبطة بمستضد ذي أهمية.
في مختبري ، نقوم بهندسة العلاجات الخلوية من الجيل التالي من خلال الجمع بين هندسة البروتين والهندسة الخلوية. لذلك نقوم بهندسة مكونات البروتين للحصول على وظائف جديدة أو لتحسين الوظائف الحالية ، ثم ندمج هذه البروتينات الفارغة في العلاجات الخلوية. لقد قمنا بتطوير عرض سطح الاستخدام للتطبيقات المتخصصة بما في ذلك هندسة استقرار البروتين ، وهندسة مفاتيح البروتين المنظمة للجزيئات الصغيرة ، والاستهداف المحدد لتأكيدات المستقبلات المنشطة المرتبطة بالسرطان.
تتمثل ميزة عرض سطح الخميرة مقارنة بتقنيات العرض الأخرى مثل العاثيات أو عرض الريبوسوم في التصور الخلوي للتدفق للمكتبة أثناء عملية الفرز والتحكم الدقيق في ظروف الاختيار ، مثل تركيز المستضد وصرامة بوابة الفرز. للبدء ، قم بإعداد الخرزات لاختيار الخرزة الأولى عن طريق تعليق 10 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي المرتبط بالبيوتين في 990 ميكرولتر من PBSA. للغسيل ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين مع فتح الغطاء.
ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الخرزات المغسولة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل في مليلتر واحد من PBSA مع 6.7 إلى 33 بيكومول من مستضد البيوتينيل. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين مع فتح الغطاء ، وقم بإزالة المادة الطافية واغسل الخرز المحمل بالمستضد بمليلتر واحد من PBSA.
بمجرد أن تستقر الخرزات ، قم بإزالة PBSA. ثم أعد تعليق الخرز المحمل بالمستضد في 50 ميكرولتر من PBSA. تحضير الخلايا وخرز المستضد ومحلول حبات الدب للاختيارات السلبية.
بعد الغسيل ، قم بتعليق حبات المستضد في 50 ميكرولتر من PBSA وأعد تعليق حبات الدب في 150 ميكرولتر من PBSA. للاختيار السلبي الأول ، أضف 50 ميكرولترا من الخرز العارية المغسولة إلى 950 ميكرولتر من الخلايا المغسولة في PBSA واحتضن الخليط لمدة 1.5 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب التي تحتوي على معلقات خلية حبة الدب على رف مغناطيسي مع فتح الغطاء.
ماصة أي سائل في الغطاء في الأنبوب ، وانتظر لمدة دقيقتين. ثم انقل الخلايا غير المنضمة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 50 ميكرولترا من حبات الدب المغسولة. بعد ثلاث جولات من الاختيار السلبي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الخرزة المحمل بالمستضد إلى الخلايا.
احتضان لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. الآن ضع الخلايا التي تحتوي على الخرز المحمل بالمستضد على رف مغناطيسي مع فتح الغطاء. ماصة أي سائل موجود في الغطاء في الأنبوب.
انتظر لمدة دقيقتين قبل التخلص من الخلايا غير المنضومة. قم بتنفيذ جميع الخطوات المتبقية كما هو موضح لاختيار حبة المستضد الأولى. بعد ثلاثة اختيارات سلبية وواحدة إيجابية ، قم بتعليق الخلايا بسرعة في مليلتر واحد من SDCAA ونقلها إلى قارورة شاكر تحتوي على حجم أكبر من SDCAA.
بعد الحث بين عشية وضحاها للتعبير السطحي عن البروتينات في SGCAA في مكتبات الخميرة ، قم بحفر خلايا كافية لتغطية 10 أضعاف التنوع والتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في PBSA وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. استخدم 30 مليون خلية للتلطيخ في كل أنبوب.
قم بإعداد أكبر عدد ممكن من الأنابيب حسب الحاجة بناء على التنوع ، بما في ذلك أنبوب تحكم واحد بدون المستضد. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2000 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBSA التي تحتوي على المستضد ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.
بعد إجراء الطرد المركزي مرة أخرى ، قم بإزالة PBSA من الحبيبات. بعد ذلك ، قم بتعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBSA البارد الذي يحتوي على أجسام مضادة لتلطيخ العرض واكتشاف المستضد. احتضن لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 2000 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أضف ملليلتر واحد من PBSA إلى الحبيبات وكرر الطرد المركزي. ثم قم بإزالة معظم المادة الطافية ، ولم يتبق سوى 20 إلى 30 ميكرولترا لمنع الجفاف من الحبيبات.
أعد تعليق الحبيبات في PBSA البارد قبل الفرز مباشرة. الآن قم بفرز الخلايا مباشرة إلى SDCAA وسيط. بعد الفرز ، انقل الخلايا إلى قارورة شاكر تحتوي على حجم أكبر من وسط SDCAA وتحتضن عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول الخطوات الأساسية لإجراء حملات اختيار عرض سطح الخميرة لإثراء متغيرات البروتين المرتبطة بمستضد معين. تسمح الطريقة بالتحكم الدقيق في شروط الاختيار والتصور المطياف الخلوي أثناء عملية الفرز.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- هندسة البروتين
- الهندسة الخلوية
- تطوير العلاجي
الخلفية
- عرض سطح الخميرة هو أداة قوية لهندسة البروتين.
- يمكنه تمكين تصور المكتبات أثناء الفرز.
- يسمح بالتحكم في تركيز المستضد وصرامة الفرز.
- يستخدم لتطبيقات مثل هندسة استقرار البروتين والعلاجات الموجهة.
هدف الدراسة
- إثراء متغيرات البروتين التي ترتبط بمستضدات معينة.
- تحسين كفاءة العلاجات الخلوية.
- تطوير مفاتيح بروتينية جديدة تنظمها الجزيئات الصغيرة.
الطرق المستخدمة
- إعداد حبوب مغناطيسية رابطة البيوتين.
- الاختيار السلبي باستخدام الحبوب العارية المغسولة والخلايا.
- الاختيار الإيجابي مع حبوب محملة بالمستضد.
- فرز الخلايا الغنية باستخدام القياس المطياف الخلوي.
النتائج الرئيسية
- إثراء ناجح لمتغيرات البروتين المرتبطة بالمستضدات.
- تبين التحكم في شروط الاختيار.
- استرجاع فعال لمتغيرات البروتين المرغوبة لمزيد من الدراسة.
الاستنتاجات
- عرض سطح الخميرة فعال لاختيار متغيرات البروتين.
- يوفر منصة قوية لتطوير العلاجات من الجيل التالي.
- يسهل التقدم في هندسة البروتين والتطبيقات العلاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Yeast surface display enables rapid, high-fidelity engineering of protein variants with improved or novel binding properties, directly supporting early-stage therapeutic discovery. The method's integration of phenotype-genotype linkage and flow cytometric selection enhances predictive confidence in target validation and lead identification. This platform is broadly accessible and scalable, positioning it as a reusable capability for protein engineering pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting protein variants with desired binding profiles.
- Supports biological de-risking through precise control of selection stringency and antigen concentration.
- Facilitates functional target validation by linking protein phenotype to genotype for downstream analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by enriching high-affinity binders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast-displayed protein libraries for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and enhances reproducibility via flow cytometric visualization and sorting.
- Enables quantitative assessment of binding affinity and specificity for reliable compound evaluation.
- Supports scalable enrichment and reuse of engineered protein variants across campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered proteins with disease-relevant targets for translational continuity.
- Provides a robust platform for preclinical validation of protein-based therapeutics.
- Reduces mechanistic ambiguity by enabling selection for stability and functional activity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative enrichment data.
Pipeline & Workflow Integration
Yeast surface display fits at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical validation, enabling iterative optimization of protein therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by selecting for functional protein variants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for affinity and specificity assessment.
- Analytics: Provides flow cytometric and sequencing data to compare variant performance across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by generating candidates with validated binding properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to diverse protein engineering objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein engineering.
- Operational Value: Standardizes and streamlines selection workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and flow cytometry for optimal execution.
- Needs access to flow cytometric instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of selection and sorting protocols.
- Adaptable to various protein targets and model systems with protocol adjustments.
- Dependent on library diversity and antigen availability for campaign success.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:52
Yeast Surface Display Selection Using Magnetic Beads
1:57
Second Bead Selection Round with 3 Negative and 1 Positive Selection
3:43
Flow Cytometric Sorting for Yeast Surface Display Selection of the Fn3-Based G4 Library for Binding to the Antigen
