CIRCLE-seq للاستجواب في تحرير الجينات غير المستهدف

فريقنا مكرس لتطوير الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، علاجات iPSC ، للأمراض الجلدية الشديدة غير القابلة للشفاء حاليا مثل انحلال البشرة الفقاعي الضمور المتنحي. نهدف إلى تحديد ما إذا كان التحرير الجيني الدقيق إلى جانب تمايز iPSC إلى خلايا الجلد يمكن أن يوفر خيارا علاجيا قابلا للتطبيق لهذه الحالات. يعمل التحرير الجيني في الخلايا الجسدية و iPSCs باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 على تحويل الطب التجديدي من خلال تمكين العلاجات الشخصية لمختلف الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات الجلد الوراثية.

تشمل التحديات الحالية في الهندسة الوراثية التأثيرات غير المستهدفة لمحرري الجينات. يتطلب العلاج محرري الجينات الذين يصححون الجين محل الاهتمام بدقة دون تغيير أي مواقع أخرى في الجينوم. التحدي الذي يواجهنا هو إثبات أن محرري الجينات لا يقدمون تعديلات غير مقصودة تتجاوز الجين المستهدف.

يتيح بروتوكول CIRCLE-seq تحديد المواقع المحتملة الحقيقية خارج الهدف التي قد تفوتها تقنيات أخرى مماثلة. يوفر التحليل الشامل لهذه المواقع غير المستهدفة نظرة ثاقبة حول نشاط محرري الجينوم ، مما يعزز سلامة العلاجات الجينية ، بما في ذلك علاجنا القائم على IPSC للأمراض الجلدية. بعد زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لمدة خمسة أيام ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها في 10 ملليلتر من PBS.

امزج ستة ميكرولترات من تعليق الخلية في ستة ميكرولترات من التريبان الأزرق لعد الخلايا. بعد العد ، اقتبس مرتين في 10 أس سبع خلايا لكل أنبوب. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق عند 25 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية.

قم بإعداد الموجات فوق الصوتية المركزة عن طريق توجيه ذراع التحكم. املأ الخزان بالماء النقي منزوع الأيونات. على الكمبيوتر المحمول لمحطة التحكم ، قم بالوصول إلى محطات المياه وانقر فوق ملء لبدء ملء النظام.

اضبط درجة الحرارة على 4.5 درجة مئوية. نقل 25 ميكروغراما من الحمض النووي الجيني المعزول من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى أنبوب دقيق. املأ الأنبوب بحجم إجمالي يبلغ 130 ميكرولتر باستخدام عازلة TE.

اضبط الشروط لقص الحمض النووي على متوسط طول 300 زوج أساسي ، ومدة 10 ثوان ، وقوة ذروة 70 ، ونسبة عامل العمل إلى 20 ، وانفجرت الدورات إلى 50. قسم الحمض النووي الجيني المنفصم إلى جزأين سعة كل منهما 65 ميكرولترا. قم بتنقية العينات باستخدام 1.8 ضعف حجم حبات XP ، متبوعا بفصل الرف المغناطيسي.

انقل المادة الطافية إلى لوحة PCR جديدة وقم بقياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. أخيرا ، قم بتشغيل ميكرولتر واحد من الحمض النووي الجيني للقص المشار إليه على محطة شريط. للبدء ، قم بإعادة تعليق oSQT1288 ومحول دبوس الشعر إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار في المخزن المؤقت TE.

لتلدين المحول ، امزج 40 ميكرولترا من oSQT1288 ، و 10 ميكرولترات من 10X STE ، و 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز للوصول إلى حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر. بعد تلدين المحول ، امزج 10 ميكرولترات من مخزن مؤقت ربط 5X ، وخمسة ميكرولترات من DNA ligase ، وخمسة ميكرولترات من محول دبوس الشعر الملدن ، ماصة 20 ميكرولتر من مزيج ربط المحول الرئيسي في كل عينة من الحمض النووي المملوءة التي تحتوي على خرز. ضع العينات في جهاز تدوير حراري على حرارة 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم احتفظ بها عند أربع درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.

بعد ذلك ، انقل 50 ميكرولترا من محلول رش PEG / كلوريد الصوديوم إلى الحمض النووي المرتبط بالمحول. قم بتنقية العينات باستخدام حبات XP وفصل الرف المغناطيسي. قم بتقطيع العينات ب 30 ميكرولترا من درجة الحموضة العازلة TE ثمانية وصب المواد الطافية في لوحة PCR جديدة شبه حواف.

اجمع العينات وحدد كمية الحمض النووي باستخدام مقايسة dsDNA BR. لتحضير المزيج الرئيسي للتدوير ، امزج ثمانية ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز ، و 10 ميكرولترات من 10X TD4 DNA ligase المؤقت ، وميكرولترين من T4 DNA ligase لحجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولترا. ماصة 20 ميكرولتر من التدوير الرئيسي مزيج إلى 80 ميكرولتر من 500 نانوغرام من الحمض النووي المعالج بالمستخدم PNK.

احتضان العينة في جهاز تدوير حراري عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي ، أضف 100 ميكرولتر من حبات XP إلى الحمض النووي الدائري وقم بتنقية العينات ، كما هو موضح سابقا. قم بتقطيع العينة ب 38 ميكرولترا من المخزن المؤقت TE وصب المادة الطافية في لوحة PCR جديدة شبه حواف.

لشق الحمض النووي الجيني الدائري المنقى ، قم بإعداد مزيج رئيسي للانقسام في المختبر من خلال الجمع بين خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت 10X Cas9 ، و 4.5 ميكرولتر من العقدية المقيحة Cas9 ، و 1.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الجيني لحجم إجمالي يبلغ 11 ميكرولترا. احتضن مزيج الانقسام الرئيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لتشكيل مجمعات Cas9 gRNA RNP.

قم بتخفيف 125 نانوغراما من الحمض النووي الجيني الآمن بالبلازميد المعالج ب DNase إلى حجم نهائي يبلغ 39 ميكرولتر في ماء خال من النوكلياز. بعد ذلك ، أضف 11 ميكرولترا من مزيج الانقسام الرئيسي إلى 39 ميكرولترا من الحمض النووي لحجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولترا. احتضان الخليط في جهاز تدوير حراري لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية واحتفظ به عند أربع درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.

بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من حبات XP إلى الحمض النووي المشقوق في المختبر وتنقية الحمض النووي على رف مغناطيسي. قم بإزالة الحمض النووي المنقى في 42 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. لتحليل بيانات تسلسل الجيل التالي ، قم بتثبيت الإصدار 2.7 من Python و Burrows-Wheeler Aligner و SAMtools.

قم بتنزيل الجينوم المرجعي من موقع الويب المحدد. حدد ملف FASTA للجينوم المرجعي ودليل الإخراج للتحليل والمسارات إلى أوامر BWA و SAMtools. حدد التسلسلات المستهدفة والمسارات إلى ملفات FASTQ غير متعددة الإرسال لكل من عينات النوكلياز المشقوقة وعينات التحكم.

قم بتنفيذ التحليل القياسي المستند إلى المراجع باستخدام الأمر التالي. عند تنفيذ المسار الكامل، حدد موقع نتائج الإخراج لكل خطوة في مجلد إخراج مميز مخصص لتلك الخطوة المحددة.