عزل وتوصيف وتحليل البروتينات للحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما لاكتشاف المؤشرات الحيوية للقلب والأوعية الدموية

تعد الحويصلات خارج الخلية المنتشرة كمؤشرات حيوية مجالا جديدا نسبيا في أبحاث المؤشرات الحيوية ذات الإمكانات الهائلة. يهدف بروتوكولنا إلى توفير نهج عملي لتنفيذ اكتشاف العلامات الحيوية المرتبطة بالحويصلة خارج الخلية واكتشافها في قسم الطوارئ. أظهرت الأدلة الناشئة أن الشحنة الجزيئية الموجودة في الحويصلات خارج الخلية والدورة الدموية تحتوي على بروتينات والحمض النووي الريبي المثير للاهتمام في سياقات الأمراض المتعددة.

تم ربط العديد من الحويصلة الجديدة خارج الخلية والمؤشرات الحيوية المغلقة بتشخيص وتشخيص العديد من كيانات أمراض القلب والأوعية الدموية. تتمثل التحديات الرئيسية في مجال اكتشاف المؤشرات الحيوية للحويصلات خارج الخلية في الحفاظ على الحويصلات خارج الخلية واكتساب البلازما التي تعتمد على ديناميكيات إطلاق EV. لذلك ، يعد البروتوكول الصارم المضمن في الروتين السريري ضروريا لتجنب تدهور EV والحفاظ على نتائج قابلة للتكرار ، لا سيما عند تطبيق طرق تحليل واسعة النطاق مثل البروتينات.

يعتمد اكتشاف المؤشرات الحيوية البروتينية المغلقة داخل المركبات الكهربائية المنتشرة بشكل كبير على وقت سحب الدم الأولي بالنسبة لظهور الأعراض ، ومدة تخزين العينة بسبب تدهور المركبات الكهربائية الطبيعي. يقدم هذا البروتوكول بروتوكولا عمليا لعزل المركبات الكهربائية في البلازما وإدخاله في تحليل البروتينات ليتم دمجه في سير العمل السريري لقسم الطوارئ. سيركز بحثنا القادم على دمج مجموعات المرضى المختلفة في منهجيتنا من بينها المرضى الذين يعانون من قصور القلب اللاتعويضي أو عدم انتظام ضربات القلب أو اعتلال عضلة القلب ، بالإضافة إلى الدراسات الطولية للمرضى الذين يخضعون لجراحة المجازة.

باستخدام هذا البروتوكول ، نهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة المرتبطة بالمركبات الكهربائية التي تساهم في تشخيص وتشخيص الأمراض المذكورة أعلاه. للبدء في الطرد المركزي لبلازما الدم البشري ، باستخدام جهاز طرد مركزي فائق مع دوار بزاوية ثابتة دون كسر. بعد أن يستقر الحطام والجسم موت الخلايا المبرمج ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي فائق عند 100،000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية دون كسر لعزل الحويصلات خارج الخلية.

قم بإزالة الأنبوب بعناية بعد الطرد المركزي الفائق. باستخدام ماصة إلكترونية ، قم بشفط المادة الطافية برفق ، مع ترك ما يقرب من ملليلتر واحد من البلازما المستنفدة خارج الخلية. قم بالتبديل إلى ماصة سعة 1000 ميكرولتر لسحب ماصة البلازما المتبقية بعناية دون إزعاج حبيبات الحويصلة خارج الخلية.

قم بإمالة الأنبوب تدريجيا أثناء سحب العينات لضمان عدم بقاء البلازما وإعادة تعليق الحبيبات في PBS. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول مخزون الحويصلة خارج الخلية باستخدام PBS البارد بنسب مختلفة لتحقيق نطاق عد نهائي من 10 إلى 100 جسيم نانوي لكل إطار أثناء التتبع. قم بتشغيل أداة NTA وقم بتشغيل البرنامج القابل للتطبيق على الكمبيوتر المتصل.

أدخل الغرفة في تابوت الليزر وانقر على بدء تشغيل الكاميرا لتنشيطها. ارسم ملليلتر واحد من PBS في حقنة وقم بتوصيله بالأنبوب الأمامي. اغسل نظام الأنابيب جيدا ، مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء في الغرفة.

راقب الكاميرا لاكتشاف أي فقاعات هواء أو جزيئات ملوثة. الآن ارسم الحويصلة المحضرة خارج الخلية التخفيف في حقنة ملليلتر واحد وحقنها في الغرفة. انتقل إلى علامتي التبويب الالتقاط والمعالجة لضبط كسب الشاشة لمطابقة سطوع الشاشة.

قم بتعديل مستوى الكاميرا لتحسين تمايز الجسيمات النانوية على الشاشة. قم بتعيين حد الكشف المناسب في علامة تبويب العملية للتمييز بين الجسيمات وضوضاء الخلفية. قم بتركيز الكاميرا باستخدام عجلة التركيز البؤري على كل جانب من جوانب الجهاز حتى تظهر الجسيمات النانوية حادة على الشاشة.

بعد ضبط درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 درجة مئوية لجميع القياسات في إعدادات الأجهزة ، انقر فوق الزر تشغيل لبدء القياس. سجل ثلاثة مقاطع فيديو على الأقل مدة كل منها 30 ثانية لكل عينة تشغيل. انقر فوق تغيير لإدخال عامل تخفيف العينات ، وأخيرا انقر فوق تصدير لحفظ النتائج.

باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، تم تحديد الحويصلات خارج الخلية وتصورها بناء على الكعكة والحركة. كشف التحليل عن متوسط تركيز الجسيمات 1.2 في 10 إلى قوة 10 جسيمات لكل مليلتر في البلازما من الأفراد الأصحاء مما يدل على وجود حويصلات خارج الخلية. تم قياس متوسط حجم حويصلات البلازما خارج الخلية عند 184.7 نانومتر ، بما يتفق مع أبعاد الحويصلة النموذجية خارج الخلية.