Name: تقييم نشاط DNase عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: اكتشف تقييم نشاط DNase باستخدام تقنية نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي. تتيح هذه الطريقة الكشف الحساس عن النوكليازات الضعيفة ودراسة تأثير درجة الحموضة والحرارة على فعالية الإنزيم في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. 
 <a target="_blank" href="https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081">https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081</a> (2018).</li>
<li>Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Front Plant Sci. 4, 413(2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Chai, H., Tang, Y., Guo, Z., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+electrochemical+switch+for+circulating+tumor+DNA+through+recycling+activation+of+blocked+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric electrochemical switch for circulating tumor DNA through recycling activation of blocked DNAzymes.</a> Anal Chem. 94 (6), 2779-2784 (2022).</li>
<li>Liu, G., Ma, X., Tang, Y., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+fluorescence+method+for+ctDNA+analysis+based+on+the+construction+of+a+DNA+four-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Ratiometric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction.</a> Analyst. 145 (4), 1174-1178 (2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoblinker%3A+Brownian+motion+powered+bio-nanomachine+for+FRET+detection+of+phagocytic+phase+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nanoblinker: Brownian motion powered bio-nanomachine for FRET detection of phagocytic phase of apoptosis.</a> PLoS One. 9 (9), e108734(2014).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+FRET+labeling+and+analysis+of+phagocytic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Express FRET labeling and analysis of phagocytic clearance.</a> Methods Mol Biol. 1644, 3-11 (2017).</li>
<li>Domingo, B., Sabariegos, R., Picazo, F., Llopis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+FRET+standards+by+steady-state+fluorescence+and+lifetime+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods.</a> Microsc Res Tech. 70 (12), 1010-1021 (2007).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. S., Sessler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+ratiometric+fluorescence+probes+for+cations%2C+anions%2C+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based ratiometric fluorescence probes for cations, anions, and biomolecules.</a> Chem Soc Rev. 44 (13), 4185-4191 (2015).</li>
<li>Torriglia, A., Leprêtre, C., Padrón-Barthe, L., Chahory, S., Martin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+L-DNase+II+activation+and+function+as+a+molecular+switch+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of L-DNase II activation and function as a molecular switch in apoptosis.</a> Biochem Pharmacol. 76 (11), 1490-1502 (2008).</li>
<li>Padron-Barthe, L., Leprêtre, C., Martin, E., Counis, M. F., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+modification+of+serpins+transforms+leukocyte+elastase+inhibitor+into+an+endonuclease+involved+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational modification of serpins transforms leukocyte elastase inhibitor into an endonuclease involved in apoptosis.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4028-4036 (2007).</li>
<li>Torriglia, A., Martin, E., Jaadane, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hidden+side+of+SERPINB1%2Fleukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The hidden side of SERPINB1/leukocyte elastase inhibitor.</a> Semin Cell Dev Biol. 62, 178-186 (2017).</li>
<li>Torriglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DNase+II%2C+a+molecule+that+links+proteases+and+endonucleases+in+apoptosis%2C+derives+from+the+ubiquitous+serpin+leukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">L-DNase II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from the ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor.</a> Mol Cell Biol. 18 (6), 3612-3619 (1998).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. (32), e1485(2009).</li>
<li>Lauková, L., Konečná, B., Janovičová, Ľ, Vlková, B., Celec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribonucleases+and+their+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deoxyribonucleases and their applications in biomedicine.</a> Biomolecules. 10 (7), 1036(2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+detection+of+nucleolytic+and+proteolytic+markers+of+lysosomal+cell+death%3A+DNase+II-type+breaks+and+cathepsin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual detection of nucleolytic and proteolytic markers of lysosomal cell death: DNase II-type breaks and cathepsin D.</a> Methods Mol Biol. 1554, 229-236 (2017).</li>
<li>Nucleases (DNases and RNases). , Sigma-Aldrich. 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases">https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases</a> (2025).</li>
<li>Altairac, S., Zeggai, S., Perani, P., Courtois, Y., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+Na%2B%2FH%2B+antiport+inhibition+activates+the+LEI%2FL-DNase+II+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by Na+/H+ antiport inhibition activates the LEI/L-DNase II pathway.</a> Cell Death Differ. 10 (5), 548-557 (2003).</li>
<li>Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacons+as+a+sensitive+fluorescence+assay+for+enzymatic+cleavage+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (11), E52(2000).</li>
<li>Ma, C., Tang, Z., Huo, X., Yang, X., Li, W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+double-stranded+DNA+cleavage+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of double-stranded DNA cleavage using molecular beacons.</a> Talanta. 76 (2), 458-461 (2008).</li>
</ol>

نهج التألق النسبي هو طريقة تحليلية تستخدم نسب إشارات التألق بدلا من الاعتماد فقط على شدة إشارة واحدة1،2. تتمثل ميزة استخدام النسب في أنها توفر معايرة داخلية وتعوض العديد من العوامل العشوائية ، مثل الاختلافات في تركيزات العينة والمسبار ، ومعلمات الأداة ، وما إلى ذلك. هذا يعزز دقة وحساسية مجسات الفلورسنت.
في السياق المحدد لمجسات نقل طاقة الرنين Förster (FRET) ، يشير مصطلح "قياس النسبة" إلى حقيقة أن القياس يعتمد على نسبة إشارتي انبعاث من زوج من الفلوروفورات المانحة والمستقبلة FRET. لتحديد نشاط التحليل المستهدف ، تستخدم مجسات FRET النسبية نسبة شدة الانبعاثات من المستقبل / المانح (أو ، في بعض الحالات ، نسبة المتبرع / المستقبل المقلوب). ترتبط النسبة ارتباطا مباشرا بكفاءة FRET. يوفر آلية تطبيع ذاتية تقلل من ضوضاء الخلفية وتأخذ في الحسبان الاختلافات في ظروف الإضاءة وتركيز المسبار3.
تشمل التطبيقات الحديثة المثيرة للاهتمام لطريقة قياس النسبة استخدامها في أجهزة الاستشعار الحيوية الكهروكيميائية النسبية للكشف عن الحمض النووي للورم المتداول (ctDNA) 4،5 ، في الآلات النانوية الحيوية التي تعمل بالحركة البراونية للكشف عن FRET للمرحلة البلعمية من موت الخلايا المبرمج6 ، ولوضع العلامات السريعة FRET وتحليل إزالة البلعمة7. يعد نهج FRET النسبي الموصوف في هذا العمل مفيدا للتقييم الكمي لنشاط DNase. تستند قياسات الفحص إلى نسب انبعاثات زوج FRET. نظرا لقدرته على اكتشاف انقسام الحمض النووي البسيط والبطيء ، فإن الاختبار مناسب بشكل خاص للتحقيق في النشاط المحلل للنواة الضعيف الذي يتطلب فترات مراقبة أطول وللتجارب على مستويات الأس الهيدروجيني المختلفة.
هنا ، يتم توضيح بعض المزايا المحددة لمقايسة FRET النسبية من خلال تطبيقه لدراسة نشاط DNase لمثبط الإيلاستاز النوكلياز والكريات البيض الضعيف (LEI). يتضمن التقرير بروتوكولا مفصلا مع إرشادات خطوة بخطوة ووصفا لتحليل بيانات قياس النسبة.
وصف مسبار FRET النسبي
مسبار FRET النسبي هو أوليغو DNA 38-mer مكمل ذاتيا يحمل زوج FRET المتبرع والمتقبل من FAM-TAM (Fluorescein-Tetramethylrhodamine). تسلسله هو 5'-AAGGGT (TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT (FAM) T-3'. يفترض 38-mer ذاتي التهجين شكلا أساسيا ، يتألف من دبابيس شعر متصلة من 23 و 15 نيوكليوتيد ، والتي تضع اثنين من الفلوروفورات 23.8 Å من بعضهما البعض. هذا أقرب بكثير من نصف قطر فورستر لهذا الزوج ، R0 = 55 Å8. يتوافق هذا التحديد مع كفاءة عالية جدا لنقل الطاقة من المانح إلى المستقبل7: EFRET = 0.993477. نتيجة لذلك ، عند إضاءته عند الطول الموجي للإثارة FAM (488 نانومتر) ، ينبعث مسبار FRET من التألق عند الطول الموجي للانبعاث للمستقبل TAM (580 نانومتر) ، بينما يتم قمع انبعاث FAM (525 نانومتر).
يوضح الشكل 1 أ الهيكل الثانوي الذي تنبأ به UNAFold للمسبار ، مع حلقات صغيرة في كل من قمم دبوس الشعر بسبب العائق الفراغي من الانحناء الضيق. يتم عرض الرسم التخطيطي للكشف عن كسر الحمض النووي بواسطة مسبار FRET في الشكل 1 ب. يظهر أن كسر المسبار قليل بواسطة DNase يفصل زوج FRET الخاص به. ينتج عن هذا الفصل تغييرات جذرية في أطياف الانبعاث لكل من الفلوروفورات في المسبار. يعرض الشكل 1C أطياف انبعاث المسبار قبل وبعد انقسامه ويوضح أن انقسام زوج FRET بعد انقسام مسبار DNase II يزيد من انبعاث المتبرع عند 525 نانومتر (ID 525 نانومتر) ويقلل في نفس الوقت من انبعاث المستقبل عند 580 نانومتر (IA 580 نانومتر). يوضح الشكل 1D نسب PAGE gel و FRET المقابلة لأطياف الإرسال. أنتج انقسام مسبار DNase II شريطين عريضين يقابلان شظايا 12-16-mer FAM (أخضر) و 20-24-mer TAM (أحمر) ، مما يشير إلى قطع عشوائية ل 38-mer على جانبي T23 بالقرب من منطقة الاتصال بين دبابيس الشعر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
الشكل 1: هيكل وتشغيل مسبار FRET النسبي. (أ) الهيكل الثانوي المتوقع لمسبار FRET الذي تم إنشاؤه بواسطة UNAFold. (ب) التمثيل التخطيطي للمسبار العامل FRET. مسبار FRET النسبي هو قليل النوكليوتيدات 38 مير على شكل ديلة مسمى بمتبرع FRET (FAM) ومتقبل (TAM) على مسافة FRET فعالة تبلغ 23.8 Å ، مما يضمن كفاءة FRET بنسبة &gt;99٪. انقسام المسبار قليل بواسطة DNase يفصل زوج FRET ، مما يلغي FRET. (ج) أطياف الانبعاثات لمسبار FRET قبل وبعد الانقسام بوساطة DNase II. قبل الانقسام ، يتم قمع انبعاث FAM ، ويكون انبعاث TAM بارزا. يفصل الانقسام بوساطة DNase بين FAM و TAM ، ويستعيد انبعاث FAM (ذروة 525 نانومتر) ويلغي انبعاث TAM (انخفاض 580 نانومتر). λالإثارة = 488 نانومتر. (د) التقييم النسبي والكهربي لمسبار FRET قبل وبعد انقسام DNase II. اللوحة العلوية: نسب FRET (RD / A = ID 525 نانومتر / IA 580 نانومتر) ، تمثل مقياسا كميا لحالة المسبار. أحمر: غير مشقوق. الأخضر: DNase II-مشقوق. اللوحة السفلية: تغيير طبيعة هلام PAGE المقابل للبيانات الفلورومترية. ينتج عن انقسام DNase II شظايا تحمل علامة FAM (12-16 nt ، خضراء) وشظايا تحمل علامة TAM (20-24 nt ، أحمر) ، مما يشير إلى الانقسام بالقرب من الاتصال بين دبابيس الشعر ، ويحيط ب T23. يظهر التحكم غير المشقوق التألق الأصفر. سلم: قليل النوكليوتيدات المسماة FAM و TAM المقابلة للأجزاء 5 و 3 من المسبار 38 مير ، مع ملصقات الفلورسنت في مواقعها الأصلية. ظروف التفاعل: 10 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.2) ، 1 جزء من الميكرولتر / ميكرولتر مسبار FRET ، 0.0033 وحدة / ميكرولتر DNase II ، 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. RD / A = ID 525 نانومتر / أناأ 580 نانومتر ؛ λالإثارة = 488 نانومتر. UNAFالظروف القديمة: 1 ميكرومتر مسبار FRET ، 10 ملي مولار Na + ، 0 ملي مولار2+ ، 37 درجة مئوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وفي حين أن التغيرات في أطياف البث الاختبارية الفردية واضحة، فإن المقارنات الكمية بين الأعداد الكبيرة من أطياف البث تتطلب معلمة كمية أكثر سهولة في الاستعمال وأكثر إحكاما. يتم لعب هذا الدور من خلال نسبة FRET. تنتمي طريقة التألق المعروضة إلى مجموعة من الأساليب النسبية التي تعتمد على النسب المباشرة (ثنائية القناة) لانبعاثات التألق لأعضاء زوج FRET لتقييماتهم الكمية2،9.
يستخدم النهج نسبة انبعاثات المانحين / المستقبلين (RD / A = ID 525 nm / IA 580 nm) ، والتي ترتبط بكفاءة FRET وتميز كمية حالة 38-mer (مكسورة أو سليمة). توفر نسبة ID / IA آلية تطبيع ذاتي تمثل بطبيعتها الاختلافات في عوامل مثل تركيز المسبار وشدة الإثارة والتبييض الضوئي3. هذا النهج مناسب فقط لمجسات FRET التي يرتبط بها مانح ومتقبل داخل نفس المسبار ، حيث تكون نسبتها معروفة وثابتة. لهذا السبب ، لا يحتاج النهج إلى النظر في الإثارة المباشرة للحديث المتبادل للمتقبل أو المتبرع2. يضمن القياس المتكافئ الثابت للمتبرع والمستقبل للمسبار عدم تأثر نسب انبعاث المانح / المستقبل بهذه الاختلافات وتعكس بشكل مباشر حالة المسبار. نتيجة لذلك ، توفر نسبة انبعاثات المتبرع إلى المستقبل معلمة انقسام الحمض النووي الكمي مع تطبيع إشارةمدمج 2،3.
يستخدم الفحص نسبة ID / I A (بدلا من نسبة IA / ID ) لأن هذه النسبة تصف توقف FRET بعد انقسام المسبار وبالتالي تتغير في نفس اتجاه زيادة نشاط DNase مع زيادة الانقسام. يتضح ذلك من خلال الشكل 1D ، والذي يوضح نسبة FRET للمسبار النسبي والرحلان الكهربائي PAGE قبل وبعد انقسامه بواسطة DNase II ، وكلاهما يتوافق مع الأطياف في الشكل 1C. لإثبات راحة مقايسة FRET النسبية ، والوقت الاقتصادي ، وسهولة الاستخدام ، تم تطبيقه للكشف عن ودراسة نشاط DNase لمثبط الإيلاستاز النوكلياز والكريات البيض الضعيف (LEI).
معرف كيان قانوني ضعيف للنوكلياز
معرف الكيان القانوني لمثبطات الإنزيم البروتيني قابل للاستقرار بشكل طبيعي، أي غير متوازن طوبولوجيا. هذه الميزة ضرورية لآليتها المثبطة. عندما يشق البروتياز المستهدف حلقة الموقع التفاعلي لمعرفات الكيانات القانونية (RSL)، يخضع جزيء مثبط الإنزيم البروتيني لتغيير توافقي جذري، مما يؤدي إلى شد البروتياز ميكانيكيا إلى شكل غير نشط10،11. ومن اللافت للنظر أن هذا يكسر أيضا جزيء معرفات الكيانات القانونية نفسه ويكشف عن موقع DNase مشفى مغطى في حظره الأصلي، وبالتالي تحويل معرفات الكيانات القانونية إلى نوكلياز داخلي نشط L-DNase II (DNase II المشتق من معرفات الكيانات القانونية)11،12. يمكن أيضا أن يتعرض موقع DNase الخفي من خلال تمسخ معرفات الكيانات القانونية وكسرها الناجم عن حضانة معرفات الكيانات القانونية طوال الليل عند درجة الحموضة 2 في حمض الكبريتيك10،13. أظهر استخدام مقايسة FRET هذه لدراسة معرفات الكيانات القانونية أن علاجات التمسخ الكيميائي القاسية والانقسام الأنزيمي المستهدف ليست مطلوبة بشكل صارم لكشف نشاط التحلل النووي الكامن لمعرفات الكيانات القانونية.
يصف التطبيق والبروتوكول المقدمان لنهج FRET النسبي الكشف عن نشاط DNase الضعيف الموجود بطبيعته في معرفات الكيانات القانونية العادية غير المشوهة. كان اكتشاف القدرة المحللة للنواة الجوهرية لمعرفات الكيانات القانونية غير المشقوقة وتحليلها ممكنا بسبب ملاءمة الاختبار لفترات طويلة من الملاحظة عند مستويات الأس الهيدروجيني الحمضية المختلفة.

<table><tbody><tr><td>96 لوحة بئر</td><td>صقر</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>مسبار الحمض النووي FRET</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG TT (FAM)T- 3'; FAM &ndash; فلورسين-دي تي. &nbsp; تام &ndash; رباعي ميثيل رودامين-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>كاميرا EVOLT الرقمية SLR</td><td>أوليمبوس</td><td>[إ500]</td><td></td></tr><tr><td>جهاز الرحلان الكهربائي هلام مع مزود الطاقة</td><td>بيو راد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>لي</td><td>نوفوبروتين</td><td>سي جيه 01</td><td></td></tr><tr><td>نظام تصوير الجل LiCOR</td><td>ليكور</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مياه خالية من النوكلياز</td><td>إنفيتروجين</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>جل PAGE قبل الصب</td><td>إنفيتروجين</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>محلول عازلة أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 5.2</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S2899-100 مل</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الطيف الفلوري</td><td>تيكان</td><td></td><td>سافير 2</td></tr></tbody></table>

تقييم نشاط dnase عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

تسلط هذه الدراسة التمثيلية الضوء على المزايا المحددة لنهج FRET النسبي القياسي للتحقيق في التفاعلات الأنزيمية البطيئة التي تتطلب فترات طويلة من المراقبة. على وجه الخصوص، يوضح التطبيق اكتشاف وتحليل نشاط DNase المتأصل في معرفات الكيانات القانونية باستخدام نظام FRET النسبي. تظهر نتائج هذه الدراسة في الشكل 2.
باستخدام هذا النهج، أظهرنا أن معرفات الكيانات القانونية تظهر نشاط DNase في ظل ظروف حمضية معتدلة ...

تقييم نشاط DNase عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

assessment-dnase-activity-ratiometric-fluorescence-resonance-energy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

تم تصميم مجموعة أدوات الكشف عن البروتياز نيون لقياس نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام قياس التألق. بل هو أيضا مناسبة للكشف عن كميات ضئيلة من التلوث البروتيني. يستند هذا الأسلوب على hydroysis بروتين من صيغة الملكية للركيزة الكازين FITC المسمى.

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

يوصف أسلوب الرواية التي تنطوي على التحليل الكمي من الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) إشارات لدراسة حركية الانزيم.

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر لتحديد نشاط بروتياز العدلات سيرين في عينات البلغم. يتم تحضين العينة التي تحتوي على البروتياز المفرز بمراسل فلوري يحمل فكرة تعرف. يتيح انقسام الشكل بواسطة البروتياز انبعاث فلورة فردية من قبل المتبرع والمتقبل للمراسل ، مما يشير إلى نشاط البروتياز في العينة.

اختبار في المختبر لقياس نشاط بروتياز العدلات سيرين باستخدام مبلغ الفلورسنت

ووصف مجموعة من فحوصات اللونية المميزة للبروتين بسرعة، RNA، DNA، وإعادة ducing السكريات في عينات غير متجانسة الجزيئية البيولوجية المحتملة.

فحوصات اللونية السريعة للتمييز نوعيا RNA والحمض النووي في العينات البيولوجية

تلعب نوكلياز خارجي أدوارا حاسمة في ضمان استقرار الجينوم. يؤدي فقدان وظيفة نوكلياز خارجي WRN إلى الشيخوخة المبكرة. يمكن أن تساعد دراسة الركائز والمتطلبات الأخرى للنوكلياز في المختبر في توضيح دوره في الجسم الحي. نوضح هنا اختبارا سريعا وقابلا للتكرار قائما على التألق لقياس نشاط النوكلياز.

مقايسة نوكلياز خارجي قائم على التألق لتوصيف DmWRNexo ، تقويم العظام لنوكاز خارجي WRN البشري ، وتطبيقه على النوكليازات الأخرى

نصف مقايسة رقمية لنقطة النهاية لقياس الأحماض النووية بقراءة مبسطة (تناظرية). نقيس التألق السائب للمقايسات الرقمية القائمة على القطرات باستخدام جهاز qPCR قياسي بدلا من الأجهزة المتخصصة ونؤكد نتائجنا عن طريق الفحص المجهري.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

نحن تقرير البروتوكولات للتوليف وتنقية ليغومرات الببتيد الأحماض النووية (السلطة الفلسطينية) التي تتضمن تعديل للمخلفات. ويرد وصف أساليب البيوكيميائية والفيزيائية لوصف الاعتراف بالجيش الملكي النيبالي الدوبلكس بالمحميات معدلة.

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

ويصف هذا البروتوكول وصف توليف دنا بوليميريز الحمض النووي تم التعديل من خلال مراقبة التغيرات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي القريبة من الأشعة تحت الحمراء باستخدام هلام التفريد وتصوير جل. المواد الهلامية الاكريلاميد تستخدم لتصوير عالية الدقة لفصل الأحماض النووية القصيرة، التي تهاجر بمعدلات مختلفة اعتماداً على حجم.

بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد

ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي هي أهداف محتملة لأدوية السرطان. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتقييم الجزيئات الصغيرة لتثبيط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يستخدم هذا الفحص نوكلياز داخلي لإقران مثيلة الحمض النووي بتوليد التألق ويسمح بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي.

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

يمكن استخدام الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي للكشف الانتقائي والحساس للغاية عن الأحماض النووية. توضح هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتصميم آلات النانو القائمة على الحمض النووي مع نواة 10-23 باستخدام البرامج المجانية وتطبيقها في الكشف عن جزء فيروس إبشتاين بار كمثال.

آلات نانوية قائمة على DNAzyme 10-23 للتعرف على الحمض النووي

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

اكتشف تقييم نشاط DNase باستخدام تقنية نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي. تتيح هذه الطريقة الكشف الحساس عن النوكليازات الضعيفة ودراسة تأثير درجة الحموضة والحرارة على فعالية الإنزيم في الوقت الفعلي.

تقييم نشاط DNase عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي

استكشف المزيد من الفيديوهات