توليد الخلايا التائية التنظيمية لمستقبلات المستضد الخيمري البشري

يصمم مختبرنا مستقبلات مناعية اصطناعية ، مثل مستقبلات المستضد الخيمري ، ويدرس كيفية تأثيرها على بيولوجيا الخلايا التائية التنظيمية. من خلال اختراع تسلسلات جديدة للحمض النووي واستخدام نماذج الفئران المتوافقة مع البشر للمرض ، نهدف إلى إنشاء علاجات هندسية للخلايا المناعية لأمراض المناعة الذاتية ورفض الزرع والسرطان والشيخوخة. عند تصميم مستقبلات مستضد خيمرية للخلايا التائية التنظيمية ، من الضروري مراعاة قوتها.

تتصرف CAR Tregs عالية التقارب مثل الخلايا التائية المستجيبة ، مما ينتج عنه زيادة السيتوكينات الالتهابية ويظهر نشاطا قتليا أكبر. يشير بحثنا المستمر إلى أن تقليل تقارب CAR يؤدي إلى تحسين ملامح السيتوكين ووظيفته في CAR Tregs. مجال CAR Treg ناشئ ويفتقر إلى التوحيد القياسي.

يقدم بروتوكولنا نهجا قويا وعالميا لإنشاء واختبار CAR Tregs. وهذا يعزز قابلية التكرار ويسرع الابتكار مع توجيه المختبرات الجديدة في أبحاث CAR Treg ، لا سيما بالنظر إلى تحديات ندرة Treg والمتطلبات المتخصصة. ندرس الآليات التي تستخدمها الخلايا التائية التنظيمية للحفاظ على التوازن المناعي وتعزيز التئام الأنسجة.

يتضمن بحثنا فهم إشارات CAR Treg ووظيفتها ، بالإضافة إلى استكشاف سياقات مرضية جديدة حيث قد يقدم علاج CAR Treg فوائد فريدة مقارنة بالاستراتيجيات الحالية. للبدء ، انقل محتويات leukopak إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف كمية متساوية من DPBS مع مصل بقري الجنين بنسبة 2٪ واخلطها برفق باستخدام ماصة.

قم بتدوير الأنبوب على حرارة 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد شفط المادة الطافية ، أعد تكوين حبيبات الخلية في ملليلترين من DPBS مع مصل بقري جنيني بنسبة 2٪. ثم أضف ثمانية ملليلتر من محلول كلوريد الأمونيوم إلى تعليق الخلية واخلطه عن طريق الانعكاس اللطيف.

مع الانفصال ، قم بتدوير الخلايا المغسولة على حرارة 150 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد شفط المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 30 مل من DPBS مع مصل بقري جنيني 2٪. بعد ذلك ، قم بالدوران من 10 إلى قوة ثمانية إلى 10 إلى قوة تسعة PBMCs عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

وإعادة التعليق في المخزن المؤقت لفصل الخلايا بتركيز خمسة في 10 أس سبع خلايا لكل مليلتر. لفرز الخلايا بمساعدة التألق للخلايا التائية التنظيمية ، قم بتدوير الخلايا الموجبة CD4 عند 500 جرام لمدة خمس دقائق. ثم أعد تكوين الخلايا في 200 ميكرولتر من DPBS.

لكل مليون خلية ، أضف ميكرولتر واحد من CD4 FITC المضاد للإنسان ، وميكرولتر واحد من CD25 APC المضاد للإنسان ، وميكرولتر واحد من CD127 PE المضاد للبشر. بعد دوامة الأنبوب برفق ، ضعه في ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بمجرد غسل الخلايا ب 10 ملليلتر من DPBS مع مصل بقري جنيني 2٪ ، قم بتدويرها عند 500 جرام لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الخلايا الملطخة برفق بمعدل 1.5 مرة 10 إلى قوة سبع خلايا لكل مليلتر في DPBS مع مصل بقري جنيني 2٪. بعد ذلك ، قم بتمرير تعليق الخلية الملونة من خلال غطاء مرشح 40 ميكرومتر إلى أنابيب فرز الخلايا بمساعدة التألق.

قم بإعداد أنابيب تجميع سعة 15 مليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط RPMI10 وضعها على الثلج. أخيرا ، قم بفرز الخلايا التائية التنظيمية السلبية CD4 ، و CD25 المرتفعة ، و CD4 الإيجابية ، و CD25 منخفضة ، والخلايا التائية التقليدية الإيجابية CD127 باستخدام فرز الخلايا بمساعدة الفلورة. للبدء ، خذ الخلايا التائية التنظيمية المعزولة من دم الإنسان بعد 48 ساعة من التنشيط وأعد تعليقها.

بعد عد الخلايا ، قم بالدوران عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتعليق الخلايا التائية التنظيمية في RPMI10 عند 1.25 في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر مع 1,000 وحدة دولية لكل مليلتر من الإنترلوكين -2. الآن ، أضف كل حصة من الفيروسات إلى 2.5 في 10 إلى قوة خمس خلايا تائية تنظيمية في 200 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

قم بتقطيع 1000 جم لمدة ساعة واحدة عند 32 درجة مئوية. انقل كل تفاعل سعة 200 ميكرولتر إلى لوحة 24 بئرا. احتضان اللوحة بالخلايا التائية التنظيمية المنقولة في حاضنة زراعة الأنسجة بين عشية وضحاها.

قم بتعبئة كل بئر إلى ملليلترين بوسط RPMI10 مع تركيز الإنترلوكين 2 النهائي هو 1,000 وحدة دولية لكل ملليلتر. تقييم كفاءة تعديل الجينات باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح هنا. للبدء ، خذ الخلايا التائية التنظيمية المعلقة مع حبات CD3 المضادة ل CD3 و CD28 في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر بعد 48 ساعة من التنشيط.

احتضان معلق الخلية في مغناطيس لمدة ثلاث دقائق. أثناء وجودك في المغناطيس ، انقل الخلايا الموجودة في الوسط عبر الماصة إلى أنبوب جديد. بعد إزالة الخرزة ، اسمح للخلايا التائية التنظيمية المفككة بالراحة في RPMI10 لمدة ساعتين.

ثم قم بتدوير الخلايا التائية التنظيمية عند 500 جرام لمدة خمس دقائق. بمجرد صب المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في وسط مصل مختزل مسخن مسبقا بأربعة أضعاف 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر. خلايا Aliquot في 100 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي ملزمة منخفضة البروتين سعة 1.5 مل.

أضف الفيروس المرتبط بمستقبلات المستضد الخيمري الغدي في تعدد العدوى 20,000 إلى كل عينة وإعادة التعليق. ثم احتضان أنابيب التفاعل في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مجمعات البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 عن طريق إضافة 8.3 ميكرولتر من بروتين Cas9 إلى 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي التوجيه الفردي ، مستهدفا موضع جين المسار.

بعد خلط المكونات جيدا ، احتضان خليط البروتين النووي الريبي لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد ذلك ، املأ أنبوب التثقيب الكهربائي الجديد بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي عالي الأسمولية. أدخل أنبوب التثقيب الكهربائي المملوء في محطة الماصة لنظام التثقيب الكهربائي حتى تسمع نقرة.

اضبط ظروف التثقيب الكهربائي على 2 ، 200 فولت ، 20 مللي ثانية ، نبضة واحدة في نظام التثقيب الكهربائي. عند اكتمال الحضانة لمدة ساعة واحدة مع الفيروس المرتبط بالغدة ، قم بتدوير الخلايا المصابة بالفيروس بوزن 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد شفط المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة تعليق الخلية الذي يوفره نظام التثقيب الكهربائي لكل عينة.

بعد ذلك ، أضف 10.8 ميكرولتر من مركب البروتين النووي الريبي لكل عينة واخلطه جيدا مع ماصة دون تكوين فقاعات. الآن ، أدخل طرف التثقيب الكهربائي سعة 100 ميكرولتر عن طريق دفع الماصة إلى محطتها الثانية لفتح المشبك. ضع الرأس العلوي للماصة في طرف التثقيب الكهربائي حتى يعشبك المشبك بإحكام مع جذع تثبيت المكبس.

حرر الزر تدريجيا مع الحفاظ على الضغط الهابط على الماصة لضمان ملاءمة الطرف بشكل مريح دون أي فجوات. بعد ذلك ، اضغط على الماصة حتى المحطة الأولى واغمر طرف التثقيب الكهربائي في خليط البروتين النووي الريبي للخلية. اسحب العينة برفق إلى الماصة دون أي فقاعات.

أدخل الماصة بطرف التثقيب الكهربائي المركب الذي يحتوي على العينة عموديا في الأنبوب E حتى يسمع صوت نقرة. بعد التأكد من الإعدادات المثلى للخلايا التائية التنظيمية البشرية ، اضغط على ابدأ على شاشة اللمس لتثقيب الخلايا بالكهرباء. انتظر حتى تكتمل شاشة اللمس.

قم بإزالة الماصة برفق وانقل العينة على الفور إلى الصفيحة المعدة المكونة من ستة آبار تحتوي على 2.5 مل من وسط RPMI10 الدافئ مسبقا الخالي من المضادات الحيوية مع إنترلوكين -2 لكل بئر. بعد هز اللوحة برفق بحركات خطية ، ضعها في حاضنة زراعة الأنسجة. في اليوم التالي، بعد 16 إلى 18 ساعة، استبدل الوسائط بوسائط تحتوي على مضادات حيوية.

عد الخلايا التائية التنظيمية المثقوبة بالكهرباء عند 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر مع 1,000 وحدة دولية لكل مليلتر من الإنترلوكين -2.