تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد
أبريل 11, 2025
يقدم هذا البروتوكول طريقة عملية باستخدام Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعا للباحثين لتوضيح الهياكل الجزيئية بكفاءة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).
يواجه تحضير عينة التبريد تحديات يمكن أن تحد من فعاليتها ، وخاصة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات. غالبا ما تؤدي هذه المشكلة إلى ضعف الدقة وانخفاض الدقة في هياكل البروتين الجديدة المنشأة. يتم استخدام طرق تجريبية مختلفة للتغلب على التوزيع غير المتكافئ للجسيمات ، بما في ذلك إضافة المنظفات أو تقليد الغشاء إلى العينة ، وتعديل فيلم دعم الشبكة وإمالة مرحلة معينة أثناء جمع البيانات.
يحلل هذا البروتوكول طريقة عملية بسيطة لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعنا للباحثين لتوضيح هياكل الجزيئات الكبيرة بكفاءة باستخدام المبرد. للبدء ، اجمع أجزاء البروتين المجمعة التي تحتوي على بروتين صدمة حرارية صغير MJ 16.5. استخدم مرشحات الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 50 كيلودالتون لتركيز الكسور عند أربع درجات مئوية إلى حوالي 65 ملليغرام.
بعد التركيز ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الركام. Aliquot 50 ميكرولتر من المواد الطافية في أنابيب PCR رقيقة الجدار 0.2 ملليلتر. للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، قم بإذابة أنبوبين من البروتين المجمدين على الجليد.
بمجرد إذابته ، انقر فوق الأنبوب عدة مرات للخلط. ثم قم بالطرد المركزي لمحلول البروتين عند 16 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الركام. بعد ذلك ، قم بحقن المادة الطافية على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم واجمع كسور شطف 0.5 ملليلتر.
اجمع الكسور الإيلوسي المقابلة للذروة ، وتظهر أعلى امتصاص للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. لتبادل العازلة ، باستخدام مقص ، قم بتقطيع غشاء غسيل الكلى إلى قطع 30 × 30 ملم. احتضان القطع في الماء المقطر أو المحاليل العازلة لتوازنها.
بعد ذلك ، أضف 55 ميكرولترا من محلول البروتين إلى غرفة بها أزرار غسيل الكلى المجهري سعة 50 ميكرولتر. أمسك غشاء غسيل الكلى عموديا باستخدام ملقط ولمس إحدى حواف الغشاء برفق على المناديل الورقية لتصريف السوائل الزائدة. قم بتغطية زر غسيل الكلى المجهري بعناية بالغشاء.
ضع الحلقة O أعلى غشاء غسيل الكلى ولفها برفق في الأخدود الموجود على حافة الزر. اغمر كل زر غسيل الكلى في دورق منفصل يحتوي على المخزن المؤقت للوجهة بحيث يكون جانب الغشاء متجها لأعلى. استخدم حقنة بإبرة رفيعة لكمة الغشاء بعناية واستعادة محلول البروتين من غرفة غسيل الكلى المجهري.
قم بتحميل خمسة ميكرولترات من العينة بتركيز 20 إلى 120 نانوغرام لكل مليلتر على شبكة تفريغ توهج. قم بإعداد ثلاث قطرات ماء سعة كل منها 50 ميكرولترا على ورقة فيلم البارافين. افركي سطح الشبكة بقطرات الماء لغسل العينة.
الآن قم بتحميل خمسة ميكرولترات من محلول أسيتات المبولة المصفى بنسبة 1٪ على الشبكة ، وقم على الفور بإزالة محلول أسيتات المبولة. قم بتحميل خمسة ميكرولترات أخرى من محلول أسيتات المبولة على الشبكة. المس برفق جانب الملقط من الشبكة بورق ترشيح لإزالة محلول التلوين الزائد وترك الشبكة تجف.
قم بتركيب الملقط ومجموعة شبكة تفريغ التوهج على الجهاز. ثم قم بتحميل أربعة ميكرولترات من العينة على جانب الكربون من الشبكة. ابدأ عملية التجميد الغاطس.
لإعداد الشبكات للتحميل على المجهر الإلكتروني للإرسال ، أو TEM ، ضع أولا صندوقا شبكيا يحتوي على شبكات مزججة في محطة تجميع الشبكة التلقائية وفك غطاء صندوق الشبكة الذي يحتوي على شبكات مزججة. ضع حلقة الشبكة التلقائية في مساحة القطع المخصصة في محطة التجميع. حرك الشبكة المزججة بعناية من صندوق الشبكة وقم بتثبيتها داخل حلقة الشبكة التلقائية.
الآن قم بمحاذاة القرص لوضع الفتحة الدائرية أعلى حلقة الشبكة التلقائية ومجموعة الشبكة. لتثبيت الشبكة في حلقة الشبكة التلقائية ، ضع أداة إدخال المشبك C أعلى الشبكة واضغط لأسفل برفق لتأمين المشبك C بالداخل. قم بتدوير القرص للخلف وانقل الشبكات المجمعة إلى صندوق تخزين الشبكة التلقائية.
قم بتجميع محطة تحميل الكاسيت وتبريدها بالنيتروجين السائل. ضع صندوق تخزين الشبكة التلقائية في محطة التحميل. انقل مجموعة الشبكة من صندوق تخزين الشبكة التلقائية إلى الدرج.
استخدم المقبض لوضع الدرج في كبسولة التحميل التلقائي. افحص الدبوس الموجود في اللودر التلقائي للتأكد من حركته الحرة والتأكد من عدم تجميده. لوحظ تراكم الجسيمات في المصفوفات على جميع الشبكات المختبرة بغض النظر عن ظروف العازلة أو تعديلات الشحنة السطحية.
أدى تركيز البروتين العالي جنبا إلى جنب مع الشبكات سالبة الشحنة في تسعة ملليمولار من الغوغاء ، و 50 ملليمولار من كلوريد الصوديوم و 0.1 ملليمولار من المخزن المؤقت EDTA إلى التوزيع المطلوب للجسيمات المفردة داخل ثقوب الشبكة ، مما يقلل من تكوين مصفوفة البروتين. أدت هذه الحالة المحسنة إلى قيمة نسبة مساحة FSC مخروطية عالية تبلغ 0.80 وقيمة SCF تبلغ 0.859 ، مما يؤكد توزيعا موحدا للجسيمات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقة عملية لمعالجة توزيع الجسيمات غير المتكافئ في تحضير العينات لمجهر الكتروني بارد (cryo-EM) باستخدام Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال. يوفر مرجعًا للباحثين لتوضيح هياكل الجزيئات الكبيرة بكفاءة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- مجهر الكتروني بارد
- تحسين تحضير العينات
- تحليل بنية الجزيئات الكبيرة
الخلفية
- يواجه تحضير العينات الباردة تحديات مثل توزيع الجسيمات غير المتكافئ.
- يمكن أن ينتج عن هذه المشكلة دقة ودقة منخفضة في هياكل البروتينات المبنية.
- توجد نهج تجريبية مختلفة لتخفيف توزيع الجسيمات غير المتكافئ.
- المنظفات، محاكيات الغشاء، وتعديلات دعم الشبكة هي استراتيجيات شائعة الاستخدام.
هدف الدراسة
- لتحليل طريقة عملية لتحسين تحضير العينات.
- لتوفير مرجع للباحثين في cryo-EM.
- لتوضيح هياكل الجزيئات الكبيرة بشكل فعال.
الطرق المستخدمة
- تجميع كسور البروتين المحتوية على البروتين الصغير من نوع MJ 16.5.
- استخدام فلاتر الطرد المركزي مع نقطة قطع الوزن الجزيئي 50 كيلو دالتون.
- تركيز الكسور عند أربع درجات مئوية إلى حوالي 65 ملليجرام.
- تنفيذ نهج تجريبية مختلفة لتحسين توزيع الجسيمات.
النتائج الرئيسية
- يعالج البروتوكول بشكل فعال توزيع الجسيمات غير المتكافئ.
- تحسين تحضير العينات يؤدي إلى دقة أفضل في cryo-EM.
- يوفر طريقة موثوقة للباحثين لتحليل هياكل الجزيئات الكبيرة.
- يوضح أهمية تحسين العينة في التقنيات البادرة.
الخلاصات
- تحسين تحضير العينات أمر حاسم لفعالية cryo-EM.
- يعتبر المنهج المقدم مرجعًا قيمًا للباحثين.
- معالجة توزيع الجسيمات غير المتكافئ تعزز التوضيح البنيوي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Optimizing cryo-EM sample preparation directly impacts the reliability of high-resolution macromolecular structure determination, a critical inflection point in early drug discovery and target validation. Addressing uneven particle distribution enhances predictive confidence in structural data, supporting downstream screening and mechanistic de-risking. This workflow refinement is highly relevant for biopharma teams seeking robust, reproducible structural insights to inform portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables accurate visualization of protein conformations for functional target validation.
- Reduces structural ambiguity, supporting mechanistic de-risking in target selection.
- Improves confidence in structure-based hypothesis testing and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of homogeneous samples for reproducible cryo-EM assays.
- Supports standardization of grid preparation, enhancing assay scalability and reliability.
- Enables quantitative assessment of particle distribution, critical for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides structural continuity from discovery to preclinical validation when disease-relevant targets are studied.
- Improves risk-adjusted advancement by ensuring structural data quality for candidate selection.
- Supports alignment of structural outputs with translational biomarker strategies when applicable.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation optimization fits at the interface of early discovery and lead identification, ensuring structural data integrity before downstream screening and preclinical modeling.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing by minimizing artifacts from uneven particle distribution.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative metrics (e.g., FSC area ratio, SCF value) to benchmark sample quality.
- Translational Research: Supports continuity of structural insights into preclinical workflows when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated use across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization of cryo-EM sample preparation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring high-quality structural data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, grid preparation, and cryo-EM instrumentation.
- Demands access to high-quality centrifugal filters, chromatography, and vitrification equipment.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and grid preparation protocols.
- May require adaptation for different protein classes or buffer conditions.
- Effectiveness depends on careful control of protein concentration and grid surface properties.
