إجراء شاشة CRISPR بالضربة القاضية على مستوى الجينوم في المختبر في الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري

العلاج بالخلايا التائية للسيارة هو نوع مبتكر من العلاج المناعي للسرطان أدى إلى مغفرة تستمر لأكثر من عقد من الزمان. ومع ذلك، لا تزال معدلات الاستجابات الدائمة محدودة. من خلال هذا البروتوكول ، نهدف إلى تعزيز فهمنا للآليات الكامنة وراء المقاومة وإنشاء أدوات لتحسين الاستجابة للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية.

يتم حاليا استخدام العديد من الأساليب لتحسين العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، بما في ذلك العلاجات المركبة وتحسين تصميم CAR ومع ذلك ، نظرا للأدلة المتزايدة على أن المظهر الجيني لمنتجات الخلايا التائية CAR قبل التسريب هو استجابة حاسمة مهمة ، أصبحت تقنيات التحرير الجيني أدوات شائعة.

أظهر التحرير الجيني للخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة (CAR) نجاحا في منع السمية وزيادة توسع وثبات الخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة المستضدة (CAR) في الدراسات قبل السريرية والسريرية. يوفر بروتوكولنا لشاشة CRISPR بالضربة القاضية على مستوى الجينوم نهجا فعالا وغير متحيز لتحديد أفضل التعديلات الجينية لتحسين وظيفة الخلايا التائية CAR.

تتطلب الاضطرابات الجينية على مستوى الجينوم ظروف اختيار واسعة النطاق وكافية لتكون فعالة. لدراسة تطور استنفاد الخلايا التائية CAR ، تعلمنا أنه يجب علينا تحفيز أكثر من 80 مليون خلية تائية CAR لمدة أسبوعين لتحديد التعديلات الجينية المثلى.

بينما تم تصميم بروتوكولنا لتقييم تطور الإرهاق ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتقييم تطور آليات المقاومة الأخرى. من خلال إكمال الشاشات على مستوى الجينوم في إعدادات مختلفة ، قد نحدد في النهاية أفضل التعديلات لتحسين الاستجابات الإجمالية للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية.

[الراوي] بعد تحويل خلايا CAR T باستخدام مكتبة CRISPR ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية لغسلها. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق العينات في 20 مل من وسط الخلية التائية. للحفاظ على عينات لتسلسل الجيل التالي ، قم بنقل ما يكفي من خلايا CAR T في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للحفاظ على تمثيل RNA الإرشادي ل 500 خلية لكل دليل RNA. الطرد المركزي العينة على حرارة 300 جرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من PBS ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. اغسل الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر بملليلتر واحد من PBS وانقل الغسيل إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم قم بالطرد المركزي للعينات على حرارة 500 جرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وتخزين كريات الخلية عند -20 درجة مئوية. لبدء الزراعة المشتركة ، أضف خلايا CAR T إلى خلايا JeKo-1 الإيجابية CD19 بنسبة واحد إلى واحد. ارفع الحجم الإجمالي للاستزراع المشترك إلى 160 مل مع وسط الخلية التائية وقم بتخزين العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لإعادة تحفيز الخلايا التائية CAR ، اجمع المزارع المشتركة في أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للعينات عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق كل عينة في 80 مل من وسط الخلية التائية وأضف 80 في 10 إلى قوة ست خلايا JeKo-1 في 80 مل من وسط الخلية التائية. قم بتخزين العينات في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم 15 ، لعزل الخلايا التائية المستضدة المستضدة للانتقال المحتاج عن الزراعة المشتركة ، قم أولا بحساب الخلايا. اجمع بين مجموعة الاختيار الإيجابية للخلايا التائية الإيجابية CD4 مع مجموعة اختيار إيجابية للخلايا التائية الإيجابية CD8 لعزل الخلايا التائية من الثقافات المشتركة CAR T JeKo-1. ثم عد الخلايا التائية المعزولة. للحفاظ على العينات لتسلسل الجيل التالي ، قم بنقل 33 في 10 إلى قوة ست خلايا CAR T في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للعينة عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من PBS ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. ثم اغسل الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر بملليلتر واحد من PBS وانقل الغسيل إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد الطرد المركزي للعينات وإزالة المادة الطافية ، قم بتخزين كريات الخلية عند -20 درجة مئوية. للبدء ، قم بعزل الحمض النووي الجيني من كريات الخلايا التائية CAR المجمدة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجيني. قم بتنقية الحمض النووي الجيني المعزول من خلال ترسيب الإيثانول عن طريق التبريد المسبق للإيثانول بنسبة 100٪ إلى -20 درجة مئوية. قم بتقسيم الحمض النووي المغطى بالتساوي في عدة أنابيب للطرد المركزي الدقيق ، مما يضمن أن كل كمية من 200 إلى 250 ميكرولترا. أضف مجلدين من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 100٪ ، و 0.1 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، وميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل مليلتر من الجليكوجين. احتضان العينات طوال الليل عند -20 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، قم بتدوير العينات عند 13,000 جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي المترسب. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الكريات بمليلتر واحد من 70٪ إيثانول عن طريق الدوران عند 7,500 جم لمدة 10 دقائق. بعد تجفيف الكريات تماما ، أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من الماء المعقم. لتحضير الحمض النووي الجيني لتسلسل الجيل التالي ، قم بإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام خليط التفاعل المحدد الموضح هنا. ثم قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام شروط ركوب الدراجات التالية. اسحب تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل عينة وقم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتشغيل ثلاثة ميكروغرامات من منتج PCR لكل عينة على جل الاغاروز 2٪. قم بإزالة منتج PCR من الجل عن طريق استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتخزين العينات المستخرجة عند -20 درجة مئوية.