تقييم إطلاق LC3-II عبر الحويصلات خارج الخلية فيما يتعلق بتراكم الحويصلات الإيجابية LC3 داخل الخلايا

يركز بحثنا على الأمراض التنكسية العصبية التقدمية التي تتميز بتراكم البروتين النووي TDP-43 في السيتوبلازم ، مثل ALS أو FTLD-TDP. نهدف إلى فهم كيفية انتشار أمراض TDP-43 عبر الدماغ بطريقة تشبه البريون. وجدنا سابقا أن إطلاق TDP-43 عبر حويصلات خارج الخلية يتم بوساطته من خلال خلل تنظيم الالتهام الذاتي.

يسهل البروجرالينين من FTLD-TDP هذه العملية. التحدي التالي هو توضيح كيفية تنظيم الالتهام الذاتي لإنتاج وإطلاق الحويصلات خارج الخلية التي تحتوي على TDP-43 ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف أهداف علاجية ل ALS أو FTLD-TDP. للبدء ، خذ خلايا HeLa المستزرعة ، وعدها باستخدام عداد الخلايا ، وقم بالبذور واحدة في عشرة أس ست خلايا على صفيحة يبلغ طولها ستة سنتيمترات تحتوي على وسط ثقافة.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول siRNA 20 ميكرومولار. امزج 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل وثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي في أنبوب منخفض الاحتباس لتحضير المحلول أ.ثم اخلطي 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل وخمسة ميكرولترات من كاشف التعدي في أنبوب منخفض الاحتباس لتحضير المحلول ب.بعد ذلك ، اخلطي المحلول أ والمحلول ب ، ثم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أضف الآن خليط المحاليل A و B إلى الوسط المستخدم لزراعة خلايا HeLa واحتضانه لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وعرض الخلايا إلى 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين ومحلول EDTA واحد مليمولار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 2.5 مل من وسط المزرعة إلى الخلايا وباستخدام ماصة نقل باستور مع طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر متصل ، قم بإعداد معلق أحادي الخلية.

بعد عد الخلايا ، قم بالبذور واحدة في عشرة أس قوة ست خلايا على صفيحة طولها عشرة سنتيمترات واحتضانها ، كما هو موضح سابقا. في نهاية الحضانة ، قم بإعداد وسط الاستزراع الذي يحتوي إما على مركبة أو 100 نانومولار بافيلومايسين A1. ثم قم بتعريض الخلايا للوسط الذي يحتوي على مركبة أو 100 نانومولار بافيلومايسين A1 واحتضانها لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اجمع كل وسط الثقافة من اللوحة التي يبلغ طولها 10 سم.

انقل الوسط الذي تم جمعه إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بطرده عند 3 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة بقايا الخلية. لعزل جزء الحويصلة خارج الخلية P1 ، انقل المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 3 ، 000 جم إلى أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي للأنبوب عند 20،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

لعزل جزء الحويصلة خارج الخلية P2 ، انقل المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 20،000 G إلى أنبوب طرد مركزي فائق. جهاز الطرد المركزي عند 110،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد مسح الرطوبة الزائدة داخل الأنبوب بمسح مختبري ، أعد تعليق الكريات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة مرتين لتحضير جزء الحويصلة خارج الخلية P1.

ثم قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب. امسح الرطوبة الزائدة داخل الأنبوب بمنديل مختبري وأعد تعليق الكريات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الفائق في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة مرتين لتحضير جزء الحويصلة خارج الخلية P2. احتضان كسور الحويصلة خارج الخلية P1 و P2 عند 100 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 10 دقائق.

بعد نقل وسط الاستزراع من اللوحة التي يبلغ طولها 10 سم إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، اغسل الخلايا في طبق 10 سم باستخدام PBS. ثم قم بتعريض الخلايا لمليلترين من 0.25٪ تريبسين ومحلول EDTA واحد مليمولار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة خمس دقائق. أضف ثمانية ملليلتر من وسط النمو إلى الخلايا.

باستخدام ماصة نقل باستور مع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر متصل، قم بعمل ماصة الخلايا لتحضير معلق أحادي الخلية. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بطرده عند 1,000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط.

أضف PBS إلى حبيبات الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 1 ، 000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة PBS ، صوتنة بيليه الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت A68 الذي يحتوي على 1٪ sarcosil. امزج 300 ميكرولتر من محللة الخلية مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة أربع مرات.

احتضان الخليط على حرارة 100 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 10 دقائق لتحضير جزء الخلية.