وضع العلامات الطرفية الفلورية وتغليف الحمض النووي الريبي الطويل للفحص المجهري أحادي الجزيء FRET-TIRF

يركز بحثنا على ديناميكيات الحمض النووي الريبي النشط التحفيزي وكيف تتغير هذه الديناميكيات في ظل ظروف بيئية مختلفة. نستخدم FRET أحادي الجزيء لدراسة تأثير عوامل مثل خطوط الوسط أحادية التكافؤ والتكافؤ ، وبروتينات المرافقة ، وعوامل الازدحام على ديناميكيات الحمض النووي الريبي. يعد دمج الفلوروفورات المانحة والمتقبلة بدقة دون تعطيل بنية الحمض النووي الريبي ووظيفته أمرا صعبا.

بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب تتبع طي الحمض النووي الريبي الديناميكي الكبير. ومع ذلك ، فإن بروتوكول وضع العلامات والتغليف المعمول به يسمح لنا بمراقبة ديناميكيات الطي للحمض النووي الريبي الوظيفي بمرور الوقت. يعالج بروتوكولنا التحدي المتمثل في مراقبة الحمض النووي الريبي الكبير والنشط تحفيزيا في الوقت الفعلي وفي ظل ظروف الفيزيولوجيا الجديدة.

من خلال وضع العلامات التساهمية على الحمض النووي الريبي والحويصلات وتغليفها ، والتي يتم تجميدها بعد ذلك على السطح ، يمكننا مراقبة وظيفة الحمض النووي الريبي باستخدام TIRF أحادي الجزيء. نحن نركز على وضع العلامات التساهمية FRET للحمض النووي الريبي التحفيزي الطويل وخاصة إنترونات المجموعة الثانية. هذا تحد بسبب تعقيدها الهيكلي.

عندما يتم تغليفها في حويصلات ، نحافظ على الحمض النووي الريبي داخل المجال الزائل للفحص المجهري TIRF ، ومع ذلك يمكن للحمض النووي الريبي أن يطفو بحرية. بهذه الطريقة ، يمكن أن يكشف smFRET عن السلوك الديناميكي للحمض النووي الريبي دون عوائق. سنواصل محاولة فهم كيفية عمل الطبيعة حقا ، مع التركيز على العلاقة بين البنية والوظيفة وديناميكيات الريبوسومات ، ومفاتيح الريبو ، والحمض النووي الريبي التنظيمي الآخر باستخدام نهج متعدد التقنيات.

لذا فإن التحرك نحو التحقيقات في ظل الظروف الفسيولوجية والخلوية سيكون تركيزا رئيسيا لعملنا في المستقبل. للبدء ، قم بتقسيم الحمض النووي الريبي محل الاهتمام ، مع وجود 50 إلى 75 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي لكل أنبوب في 55 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج ، ثم أضف 45 ميكرولترا من خليط أسيتات الصوديوم EDC / NHS درجة الحموضة 6 إلى الحمض النووي الريبي. احتضان الخليط لمدة أربع ساعات عند 25 درجة مئوية مع رجه عند 500 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي المنشطة في 95 ميكرولتر من 100 ملليمولار MOPS عازلة درجة الحموضة 7.5. ثم أضف خمسة ميكرولترات من أمين السيانين -3 السلفوني الممللي مولار إلى الحمض النووي الريبي المنشط ، واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة عند 500 دورة في الدقيقة لربط الفلوروفور بالفوسفات المنشط 5 رئيسي. في اليوم التالي ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لتحسين الفصل.

ثم قم بتنقية الفوسفات المكون من 5 رئيسيات المسمى الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب الإيثانول. بعد التنقية ، قم بتعليق الحمض النووي الريبي المسمى في 100 ميكرولتر من 100 ملليمولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، واحتضانه لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية. ثم لإزالة الأصباغ الحرة ، اغسل الحمض النووي الريبي المسمى بالماء المقطر المزدوج باستخدام ترشيح الطرد المركزي.

بالنسبة لوضع العلامات المزدوجة ، قم بتقسيم الحمض النووي الريبي ذو التصنيف النهائي المكون من 5 أوائم ، والذي يحتوي على ما يقرب من 50 إلى 75 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي لكل أنبوب في 90 ميكرولترا من المحلول. أضف خمسة ميكرولترات من أسيتات الصوديوم أحادية المولار الأس الهيدروجيني 5.5. ثم أضف أربعة ميكرولترات من محلول مخزون ميتابوردات الصوديوم الطازج سعة 500 ملليمول.

للحصول على ملصقات أحادية ذات 3 أطراف أولية ، أضف ثمانية ميكرولترات من محلول مخزون ميتابريدات. بعد احتضان المحاليل في الظلام لمدة ساعتين ، قم بتعبئة 30 ميكرولتر من 50٪ من الجلسرين لإيقاف التفاعل. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، أضف 400 ميكرولتر من خليط ترسيب أسيتات الصوديوم الإيثانول المثلج.

أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي المؤكسدة في 95 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 50 مللي مولار الأس الهيدروجيني السادسة. قم بتنقية الحمض النووي الريبي ذو العلامات المزدوجة عن طريق ترسيب الإيثانول وترشيح الطرد المركزي ، كما هو موضح سابقا. قم بإزالة الحمض النووي الريبي المنقى في الماء المقطر المزدوج.

قارن بصريا بين ألوان المادة الطافية والحبيبات التي تم الحصول عليها بعد كل خطوة. احسب الحمض النووي الريبي وتركيزات الصبغة المترافقة على مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. أكد الرحلان الكهربائي للهلام الفلوري نجاح الملصقات الفردية والمزدوجة للحمض النووي الريبي ، كما يتضح من الهجرة المشتركة للحمض النووي الريبي مع الفلوروفورات.

زادت كفاءة FRET في وجود أيونات معدنية ، مما يشير إلى طي الحمض النووي الريبي ، مما أدى إلى انخفاض في انبعاث المتبرع وزيادة في انبعاث المستقبل. لتحضير غرفة الموائع الدقيقة ، استخدم حفار الماس لحفر أربعة ثقوب في شرائح الكوارتز لتشكيل قناتين. ضع شرائح الكوارتز المحفورة وحوالي ضعف عدد الأغطية في وعاء تلطيخ زجاجي من كوبلين بغطاء.

قم بتقطيع الشرائح والأغطية في الماء المقطر المزدوج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بصوتنة البرطمان في محلول تنظيف الأواني الزجاجية المختبرية بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. بعد شطف البرطمان بالماء المقطر المزدوج ، قم بالصوتنة في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم أحادي المولار لمدة 30 دقيقة واتركه في المحلول طوال الليل.

بعد الشطف المتكرر والصوتنة بالماء المقطر ، قم بتجفيف الشرائح والأغطية باستخدام تدفق غاز النيتروجين. عالج الشرائح المجففة والأغطية بمنظف بلازما الأكسجين لمدة 30 دقيقة. ضع الشرائح والأغطية النظيفة في وعاء تلطيخ كوبلين يحتوي على محلول الإيثانول 3٪ اختبار AP Sonicate لمدة دقيقة واحدة ثم احتضنه لمدة 30 دقيقة.

اشطف الشرائح والأغطية ثلاث مرات لكل منها بالإيثانول المطلق والماء المقطر المزدوج ، ثم جففها تحت تدفق غاز النيتروجين. بعد ذلك ، قم بإعداد صندوق رطب عن طريق ملء صندوق طرف ماصة فارغ في منتصف الطريق بالماء المقطر المزدوج. ضع الشرائح داخل الصندوق بحيث يكون الجانب المراد معالجته متجها لأعلى.

أضف قطرات سعة 30 ميكرولتر من خليط bPEG / mPEG المحضر حديثا إلى وسط الشريحة لتغطية كلتا القناتين. قم بتغطية القطرة بغطاء نظيف وأغلق الصندوق الرطب. احتضن الصندوق طوال الليل في الظلام من أجل PEGylation.

في اليوم التالي ، اشطف الشرائح والأغطية المخلة ب PEG والحيوية بالماء المقطر المزدوج ولاحظ التغيير في الكراهية للماء للأسطح المعالجة. قم بتوصيل الملصق على الوجهين بالشريحة ، مما يضمن أن الملصق يغطي منطقة الاهتمام. ثم ضع الغطاء بعناية أعلى الشريحة ، مع محاذاة الأسطح PEGylated لمواجهة بعضها البعض.

انقل الغرفة المجمعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ، واملأ الأنبوب بغاز النيتروجين. للبدء ، استخدم إبرة معقمة لعمل ثقب من الداخل إلى الخارج في غطاء أنبوب معقم نظيف سعة ملليلتر. أضف 109 ميكرولتر من خليط bPE-DMPC إلى الأنبوب.

ضع قسم خلية من الورق المقوى من صندوق تخزين الأنابيب الدقيقة في قارورة Schlenk سعة 500 مل لتكون بمثابة حامل أنبوب. باستخدام ملاقط طويلة ، ضع الأنابيب التي تحتوي على خليط الدهون بحذر في حامل الأنبوب. تبخر الكلوروفورم تحت تدفق منخفض لغاز النيتروجين بين عشية وضحاها.

بعد الحصول على طبقة الدهون المجففة ، أغلق الأنابيب بالبارافيلم لتغطية الثقوب. قم بتجميع الطارد باستخدام غشاء بولي كربونات 100 نانومتر وقرص تصريف بوليستر 10 ملم. قم بموازنة المحقنة والأغشية بمخزن مؤقت مضاد للوميض.

بعد خلط الحمض النووي الريبي ذو الطرف المزدوج مع المخزن المؤقت المضاد للوميض ، قم بترطيب كعكة الدهون بخليط عازل مضاد للوميض من الحمض النووي الريبي عند 30 درجة مئوية. رج العبوة لمدة خمس دقائق عند 1,400 دورة في الدقيقة ، متبوعة ب 15 دقيقة عند 700 دورة في الدقيقة. قم بالطرد المركزي للخليط لمدة دقيقتين عند 13،000 جم ، وقم بتخفيف المادة الطافية ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المضاد للوميض.

املأ المحقنة بتعليق دهني الحمض النووي الريبي ، وبثق 35 مرة عند 30 درجة مئوية على كتلة تسخين لتغليف الحمض النووي الريبي ذو الطرف المزدوج في حويصلات فوسفوليبيد بقطر 100 نانومتر. اغسل الغرفة مرتين ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت القياسي 5X في درجة حرارة الغرفة. املأ الغرفة ب 50 ميكرولتر من 20 ميكرولتر لكل مليلتر من محلول الستربتافيدين ، واحتضنه لمدة خمس دقائق.

ثم اغسل الغرفة ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت القياسي و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المضاد للوميض. أضف 75 ميكرولترا من تعليق الحويصلة واحتضنه لمدة 10 دقائق لتثبيت الحمض النووي الريبي المغلف على السطح. بعد الشلل ، اغسل الغرفة ب 200 ميكرولتر من مخزن التصوير المعد حديثا.

للحصول على البيانات ، قم بتركيب الغرفة على مجهر TIRF واحصل على بيانات smFRET مع إثارة الليزر بالتناوب. تتبع التصوير أحادي الجزيء FRET باستخدام الفحص المجهري TIRF جزيئات الحمض النووي الريبي الفردية واكتشف التغيرات في الوقت الفعلي في كفاءة FRET. أظهرت آثار الجزيء الديناميكي أحادي الجزيء تقلبات مضادة للارتباط بين إشارات المتبرع والمتقبل ، مما يشير إلى تغيرات تأكيدية في الحمض النووي الريبي.