هندسة مستقبلات المستضد الخيمري - الخلايا القاتلة الطبيعية التي تستهدف الالتهابات الفطرية باستخدام نظام الينقولات الجمالية النائمة غير الفيروسية

نحدد بروتوكول تعداء لإنتاج خلايا قاتلة طبيعية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR-NK) التي تستهدف مسببات الأمراض الفطرية باستخدام نظام الينقولات Sleeping Beauty غير الفيروسي. لتقييم التنشيط الخاص بالمستضد ، قمنا بزراعة الخلايا المهندسة بأنابيب جرثومية Aspergillus fumigatus وقمنا بقياس إفراز IFN-γ.

يركز بحثنا على تطوير علاج خلوي جاهز لعلاج مستقبلات الاستعارة للعدوى الفطرية الغازية. نهدف إلى تحديد أفضل الأهداف وتصميمات CAR ومزيج الخلايا المناعية لتحقيق النتائج العلاجية المثلى. ركزت التطورات الأخيرة ، بما في ذلك عملنا الخاص ، على تطوير علاجات الخلايا التائية CAR التي تستهدف Aspergillus fumigatus.

أظهرت هذه الخلايا المهندسة نتائج واعدة في النماذج قبل السريرية من خلال تقليل العبء الفطري بشكل كبير ، والتحكم في المناعة المضادة للفطريات ، وتحسين البقاء على قيد الحياة بشكل عام. تتركز معظم الأبحاث في هذا المجال حاليا على إنتاج الخلايا التائية CAR الخاصة بمجموعة محدودة جدا من الأهداف باستخدام النواقل الفيروسية أو نظام الينقولات الجمالية النائمة. تتضمن التحديات الرئيسية تحديد الأهداف الفطرية المثلى وإنتاج منتج خلوي جاهز للاستخدام يكون فعالا وقابلا للتطوير للتطبيقات السريرية.

من خلال هذا البروتوكول ، نعالج الحاجة إلى طرق فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير لتوليد خلايا CAR-NK غير الفيروسية. يوفر نهجا يسهل الوصول إليه لفحص الأهداف الجديدة المضادة للفطريات ، مما يوفر خطوة أساسية نحو العلاج الخلوي الجاهز ل CAR-NK للعدوى الفطرية. للبدء ، تحقق من خلايا NK-92 تحت المجهر بحثا عن مجموعات في خلفية واضحة ، وأضف 2 مل من وسط زراعة الخلايا لكل بئر لكل حالة في صفيحة من ستة آبار وضع اللوحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

انقل 8 أضعاف 10 إلى قوة 6 خلايا NK-92 إلى أنبوب سفلي مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 200 جم لمدة خمس دقائق بتسارع وتباطؤ 3. بعد التخلص من المادة الطافية ، املأ الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية بما يصل إلى 15 مل من PBS الدافئ مسبقا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. أثناء الطرد المركزي ، تقوم الماصة بإدخال 8 ميكروغرامات من الحمض النووي البلازميد Af-CAR ، و 4 ميكروغرامات من الدائرة الصغيرة SB100X في أنبوب تفاعل واحد والحفاظ على الحمض النووي للأنبوب الثاني خاليا ليكون بمثابة تحكم وهمية.

بالنسبة لنظام التعداد، أضف 3 ملليلتر من المخزن المؤقت الإلكتروليتي في الأنبوب الأول وضعه في محطة الماصة. بعد الطرد المركزي ، تخلص برفق من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق. ثم أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل من أنبوبي التفاعل واخلطيهم برفق.

ماصة خليط خلايا الحمض النووي من أنبوب التفاعل الأول باستخدام ماصة نظام التعدي ، وأدخل ماصة الإرسال عموديا في الأنبوب الموجود في محطة الماصة. اضبط النبضة الأولى على 1 ، 650 فولت ووقت النبضة لمدة 20 مللي ثانية قبل الضغط على ابدأ لبدء النبضة. بعد النبضة الأولى ، اضبط النبضة الثانية على 500 فولت ووقت النبضة لمدة 100 مللي ثانية وابدأ النبضة الثانية.

بمجرد اكتمال النبضة الثانية، قم بإزالة الماصة ببطء من محطة الماصة. انقل الخلايا على الفور إلى بئر واحد من لوحة الثقافة المحضرة التي تحتوي على 2 مل من وسط زراعة الخلايا المسخن مسبقا وحرك اللوحة برفق بحركة دائرية لتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 30 دقيقة من الحضانة ، أضف الإنترلوكين -2 إلى الآبار بتركيز نهائي قدره 150 وحدة دولية لكل مليلتر. للبدء ، قم بنقل خلايا NK-92 بالبلازميد المطلوب. انقل الخلايا إلى أنبوب سفلي مخروطي سعة 15 مل.

ثم قم بالطرد المركزي للخلايا وتخفيفها إلى تركيز 1 إلى 2 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل 100 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت. أضف ميكرولتر واحد من البيوتين المضاد ل EGFR-T لكل 1 مرات 10 إلى قوة 6 خلايا واخلطها برفق لضمان توزيع المحلول بالتساوي. احتضان الأنبوب لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

بعد الحضانة ، املأ الأنبوب بما يصل إلى 10 مل من العازلة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 200 جم لمدة خمس دقائق مع تسارع وتباطؤ 3 ، وتخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي. ثم أضف 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد متبوعا بميكرولترين من الخرز المغناطيسي المضاد للبيوتين لكل 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا.

احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. لغسل الخلايا ، املأ الأنبوب بما يصل إلى 10 مل من العازلة وأجهزة الطرد المركزي. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة.

ضع عمود LS في المغناطيس الأقصى واغسله ب 3 ملليلتر من المخزن المؤقت. أضف تعليق الخلية بمجرد ترحيل المخزن المؤقت بالكامل عبر العمود. بعد غسل العمود ، قم بإزالته من المغناطيس وضعه في أنبوب سفلي مخروطي نظيف سعة 15 مل.

أضف 5 ملليلتر من المخزن المؤقت إلى العمود واستخدم المكبس لطرد الخلايا الموجبة EGF-R في أسرع وقت ممكن. وصلت كفاءة التعدي بعد الاسترداد إلى 10 إلى 20٪ وزاد التخصيب الأقصى من نقاء خلية Af-CAR-NK-92 إلى أكثر من 95٪ للبدء ، احصل على خلايا NK-92 المخصبة التي تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. ثم قم بإعداد تعليق Aspergillus fumigatus conidia بتركيز 2.5 في 10 أس 5 كونيديا لكل مليلتر في الوسط.

قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الكونيديا في كل بئر من لوحة استزراع 96 بئرا واحتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. في اليوم الثاني ، اغسل خلايا NK-92 المنقولة والبلازميد مرتين بالوسط وأضف 5 أضعاف 10 إلى قوة 4 خلايا NK-92 في 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من الصفيحة التي تحتوي على الفطريات للزراعة المشتركة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة لمدة 6 ساعات على الأقل.

بعد الطرد المركزي للصفيحة عند 300 جم لمدة خمس دقائق ، احصد 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر دون لمس القاع. أخيرا ، انقل المواد الطافية إلى أنابيب التفاعل لإجراء ELISA. أظهرت خلايا Af-CAR-NK-92 إفراز إنترفيرون جاما أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بخلايا NK-92 الوهمية أثناء الزراعة المشتركة مع أنابيب جرثومة الرشاشيات الدخانية.