التقدم في الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية

هنا, نقدم طريقة لتفريق وتوسيع مستقبلات المستضد الخيمري المشتق من iPSC البشري (CAR) التي تعبر عن الخلايا القاتلة الطبيعية مع تحسين القتل ضد الأورام الخبيثة المختلفة. يوضح هذا البروتوكول تمايز وتوسيع خلايا CAR-NK المحسنة المشتقة من iPSC القاتل الطبيعي (NK) وقياس النشاط المضاد للأورام ضد خطوط الخلايا السرطانية المختلفة.

يركز نطاق بحثنا بشكل أساسي على تطوير خلايا IPSC CAR NK البشرية مع تحسين النشاط المضاد للورم والثبات في الجسم الحي لعلاج الأورام الخبيثة المتنوعة بشكل أفضل. من خلال بروتوكول التوليد الجديد CAR iPSC NK ، نهدف إلى الإجابة على كيفية تغلب هذه الخلايا على المقاومة البيئية الدقيقة للورم وتحسين الفعالية وضمان الإنتاج الآمن والقابل للتطوير. تشمل التحديات التجريبية الرئيسية في تطوير خلايا CAR NK المشتقة من iPSC تحقيق تمايز متسق وفعال ل iPSC إلى وظيفية في الحالات التي تضمن التعبير المستقر عن CAR دون أي آثار ضارة وتحسين الثبات في الجسم الحي.

بالإضافة إلى ذلك ، يواجه الباحثون تحديات في قابلية التوسع والرفض المناعي وأصحاب التنظيم للتطبيقات السريرية. لقد طورنا بشكل كبير أبحاث خلايا CAR NK المشتقة من iPSC من خلال إنشاء تكامل فعال لجين CAR غير الفيروسي باستخدام تعديلات جينية قائمة على الينقولات. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتحسين CRISPR-Cas9 على مستوى iPSC لحذف نقاط التفتيش المناعية وعوامل TMA لتحسين وحالات الخلايا وفعالية الورم والثبات في الجسم الحي في نماذج الأورام الصلبة.

من خلال بروتوكولنا باستخدام التعبير الجيني ل CAR بوساطة ناقلات الظهر غير الفيروسية ، فإننا نهدف إلى سد الفجوة لتطوير تعديل جيني آمن وفعال وقابل للتطوير لخلايا IPSC CAR NK ، وتقلل هذه الطريقة من خطر الطفرات الإدخالية تعزز قابلية التكاثر والفعالية من حيث التكلفة لتوليد خلايا CAR NK للعلاج المناعي للسرطان. في المستقبل ، سيركز مختبرنا على تطوير خلايا NK المشتقة من iPSC الجديدة التي تستهدف نقاط التفتيش المناعية. سنحقق أيضا في استهداف العوامل البيئية الدقيقة المختلفة للورم باستخدام أجسام مضادة ثنائية النوعية أو ثلاثية الأنواع لتعزيز الخصوصية في الجسم الحي والنشاط المضاد للورم.

لبدء تدور الجسم الجنين أو ممر تكوين العصر الكهربائي للدولة, ما يقرب من 200, 000 هندسة CAR iPSCs لكل بئر في ستة آبار مصفوفة غشاء القاعدية لوحة مشفرة مسبقا تحتوي على فائض MT, احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون, بعد يومين, إزالة وسط الثقافة وفصل الخلايا عن طريق احتضان مع مليلتر واحد من Prewarm TrypLE Select عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بفصل مجاميع الخلية بعناية إلى تعليق خلية واحدة ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف ثلاثة ملليلتر من PBS لإيقاف تفاعل التفكك.

بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في وسط MK SR-plus وقم بتصفيتها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الركام. الطرد المركزي الخلايا. اغسل الحبيبات بخمسة ملليلتر من PBS ثم أعد تعليقها في ملليلتر واحد من وسط تكوين EB.

بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى الكثافة المناسبة باستخدام وسط تكوين EB الذي يحتوي على السيتوكينات و 10 مثبطات ROCK ميكرومولار. باستخدام بذرة ماصة متعددة القنوات من 3000 إلى 10,000 خلية لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسائط EB في صفيحة 96 بئر. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ستة أيام.

للتحقق من جودة جسم الجنين ، قم أولا بإعداد أربعة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين مسخن مسبقا مع 0.4٪ مصل دجاج لفصل EBs. بعد ستة أيام ، قم بنقل 10 إلى 30 EBs إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. أضف محلول مصل الدجاج التربسين إلى EBs واحتضنه في حمام مائي.

دوامة EBs أثناء الانفصال كل ثلاث إلى خمس دقائق لمدة 10 دقائق. ماصة التربسين EBs تختلط لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان تفكك شامل. ثم أضف خمسة ملليلتر من PBS لإيقاف عملية التربسين.

قم بتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الحبيبات في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسائط EB الجديدة. بعد العد ، قم بتلطيخ الخلايا بعلامات EB النموذجية.

أضف الحجم الموصى به من الأجسام المضادة إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا مفردة منفصلة من EB في 100 ميكرولتر من عازلة التدفق واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام عازلة التدفق. أضف بقعة SYTOX الزرقاء الحية الميتة وقم بتحليلها باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي.

ابدأ بترميز كل بئر من ستة آبار بخمسة إلى 10 ميكرولترات من محلول الجيلاتين المعقم بنسبة 2٪. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الحضانة ، قم بشفط أي محلول جيلاتين متبقي وأضف ثلاثة ملليلتر من القاتل الطبيعي أو وسط التمايز NK الذي يحتوي على السيتوكينات إلى كل بئر من ألواح الجيلاتين المغطاة بستة آبار.

بعد ذلك، باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد، انقل بعناية ماصات الدوران الدورانية المشتقة من وحدات IPSC الهندسية CAR إلى طبق بحجم 10 سنتيمترات. أضف ثلاثة ملليلتر من وسط التمايز NK الذي يحتوي على السيتوكينات إلى كل بئر من لوحة الآبار الستة. باستخدام ماصة دقيقة سعة مليلتر واحد ، توزع 16 إلى 20 EBs في كل بئر من صفيحة الآبار الستة وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

بعد الحضانة ، قم بتقييم التعبير عن علامات الخلايا القاتلة الطبيعية CD45 إيجابية و CD56 إيجابية عن طريق قياس التدفق الخلوي على خلايا المعلق. عندما يعبر أكثر من 80٪ من خلايا التعليق عن CD45 إيجابي و CD56 إيجابي. احصد الخلايا عن طريق تمريرها عبر مرشح 70 ميكرومتر لإزالة التكتلات.

قبل الزراعة المشتركة للمستضد الاصطناعي ، تقوم الخلايا العارضة بالمستضد الاصطناعي أو الخلايا المدرعة المدرعة الاصطناعية داخل الخلايا القاتلة الطبيعية بإشعاع ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعية ب 100 رمادي والحفاظ عليها كسيقان مجمدة. بعد حصاد الخلايا القاتلة الطبيعية ، قم بزراعتها بكثافة خمسة في 10 إلى قوة خمس خلايا لكل مليلتر في وسط تمدد NK مكمل ب 50 وحدة لكل مليلتر من Interleukin-2 و Interleukin-15. أضف APCs الاصطناعية المشععة الذوبان إلى الخلايا القاتلة الطبيعية بنسبة واحد إلى واحد وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

للبدء ، قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي. تقييم تعبير مستقبلات تنشيط NK على الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من الخلايا القاتلة الطبيعية المضادة GPC3 CAR iPSC لتحديد نشاط خلية حالة السيارة وحالة النضج. لفحوصات Caspase-3/7.

عد الخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC وقم بلطخها مسبقا بصبغة CellTrace Violet بتركيز نهائي من خمسة ميكرومولار في PBS تحت حماية الضوء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلايا المستهدفة للبقع في وسط مزرعة كامل قبل الزراعة المشتركة مع الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من CAR iPSC في مستجيب مختلف لنسب مستهدفة عند 37 درجة مئوية. بعد ثلاث ساعات و 30 دقيقة من الثقافة المشتركة.

أضف كاشف الكشف الأخضر Caspase-3/7 واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى. أضف محلول تلطيخ الخلايا الميتة SYTOX خلال الدقائق الخمس الأخيرة من التلوين واخلطه برفق. تحليل الخلايا الملطخة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

لوحظ تكوين EBs تدور من IPCs الهندسية GPC3 CAR في اليوم السادس. تأكيد التمايز المبكر. أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية المتمايزة أو الخلايا القاتلة الطبيعية من GPC3 CAR IPCs مورفولوجيا مميزة في مراحل مختلفة من اليوم الثالث إلى اليوم 28.

يوضح تحليل قياس التدفق الخلوي التعبير عن مستضدات المكونة للدم CD34 و CD31 بالإضافة إلى كمية صغيرة من CD43 ولكن لم يعبر بعد عن CD45 في كل من النوع البري و GPC3 CAR iPSCs المستمدة من الدوران EBs في اليوم السادس. في الحالات الخاصة بالحالات ، تم الكشف عن العلامات في النوع البري الناضج في الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC في اليوم 35. تأكيد التمايز الناجح إلى خلايا NK.

أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من النوع البري الموسع والمضاد ل GPC3 CAR iPSC علامات تنشيط مختلفة ، مما يدل على نضوج الخلايا القاتلة الطبيعية. تم تأكيد تعبير مستضد GPC3 على خطوط الخلايا السرطانية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، مما يتحقق من صحة الخصوصية المستهدفة لخلايا NK المشتقة من GPC3 CAR iPSC. أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من ANTI GPC3 CAR IPSC نشاطا أعلى سامة للخلايا ضد GPC3 تعبر عن خطوط خلايا HepG2 و SNU-449 و CAL 27 و SKOV3 مقارنة بخلايا iPSC NK من النوع البري.