قياس إعادة التدوير عالي الدقة في غرفة صغيرة الحجم

في هذه الدراسة ، نريد التحقيق فيما إذا كان يمكن استخدام حجرة الحجم الصغيرة التي تمت معايرتها إلى 0.5 مليلتر في فحوصات قياس التنفس دون المساس بالدقة التي تم الحصول عليها للحجم الكلاسيكي المليلتر في منصة Oroboros.

لقد مهد تطويرنا للغرفة الصغيرة الحجم والتقييم عن طريق قياس إعادة القياس عالي الدقة مع مراقبة الجودة الصارمة باستخدام تحليل OXPHOS الدقيق الطريق نحو التطورات والابتكارات الجديدة ، أي رقم واحد ، مقياس التنفس O2k المكون من 12 غرفة ، والثاني ، روبوت للمعايرة بالتحليل الحجمي التلقائي للمواد في البروتوكولات المعقدة المطبقة لتحليل OXPHOS. ستكون هذه التطبيقات حاسمة في التوسع نحو تحليلات الميتوكوندريا ، وتشخيص أمراض الميتوكوندريا ، وتقييم التطورات الدوائية مع التركيز على فوائد الأدوية لوظيفة الميتوكوندريا وعلى التأثيرات غير المستهدفة التي تعطل وظيفة الميتوكوندريا بشكل لا إرادي. عندما طور فريقي قياس إعادة التصفية عالي الدقة منذ أكثر من 30 عاما ، كان هناك نموذج مفاده الميتوكوندريا والميتوكوندريا والميتوكوندريا. ربما كان هناك فرق بين الميتوكوندريا العضلية والكبدية ، لكن هذا كان كل شيء. لم يكن أحد مهتما حقا بالميتوكوندريا خارج هذه النماذج. من خلال بروتوكولاتنا التي تم تطويرها لقياس إعادة التسخين عالي الدقة ، أظهرنا تنوعا كبيرا في وظائف الميتوكوندريا. يسمح لنا ذلك بتقييم التحكم في الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في أنواع الخلايا والأنسجة والأنواع المتنوعة بعين جديدة. منذ 30 عاما ، كان هناك حوالي 10 منشورات تقدر ذلك. الآن ، لدينا أكثر من 1,500 باستخدام هذه البروتوكولات.

مطلوب عينة أقل بأربع مرات في غرفة الحجم الصغير مقارنة بالغرفة الكلاسيكية المليلتر. في حالة العينة ذات معدلات التنفس المنخفضة ، يمكن استخدام نفس الكمية من العينة لزيادة تدفقات الأكسجين المحددة للحجم لتقليل عدم اليقين في القياس.

ينصب تركيز عملنا في مختبر Oroboros R&D على الجمع بين التطوير الآلي والبحث الأكاديمي. نقوم بتقييم وظيفة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا وملامح علم الوراثة الحيوية من خلال تحليل أجهزة الاستشعار المتعددة. هذا هو قياس التنفس ، وإمكانيات الأكسدة والاختزال ، وإمكانات الغشاء ، وامتصاص الكالسيوم ، وإنتاج بيروكسيد الهيدروجين ، والعديد من المعلمات الأخرى التي تسمح لنا بالحصول على نظرة أعمق على المظهر الجيني الحيوي ووظيفة الميتوكوندريا والخلل الوظيفي.

[الراوي] للبدء ، قم بتركيب الحجم الصغير ، أو غرفة SV ، على Oroboros. ثم قم بتشغيل Oroboros ، وانقر فوق Connect لتوصيل Oroboros ببرنامج DatLab. بعد تجفيف الغرف تماما ، استخدم ماصة لإضافة 0.54 مل من الماء إلى غرفة SV. ثم قم بتشغيل أدوات التقليب. قبل إغلاق الغرفة ، قم بترطيب الحلقات O للسدادات ، مع الحفاظ على الشعيرات الدموية جافة. قم بفك حلقة معايرة الحجم ، ثم أدخل السدادة لأسفل حتى يملأ السائل الشعيرات الدموية للسدادة ويتشكل الغضروف المفصلي في الوعاء في الطرف الشعري العلوي. اربط حلقة معايرة مستوى الصوت لتأمين موضعها ، مما يضمن تناسق الحجم المعاير للإدخالات المتتالية. للبدء ، املأ الغرف بوسيط التنفس MiR05 ابدأ برنامج DatLab. حدد البروتوكول المناسب لاختبار الخلفية الآلي. اضبط سرعة دوران التحريك على 550 دورة في الدقيقة ، وحجم الغرفة على 0.5 ملليلتر ، والفاصل الزمني لتسجيل البيانات عند ثانيتين ، ودرجة الحرارة التجريبية على 37 درجة مئوية. قم بإجراء اختبار النمام ومعايرة الهواء. اضبط علامة R1 على مخطط تركيز الأكسجين عن طريق تحريك المؤشر أثناء الضغط على مفتاح Shift. من حين لآخر ، قم بإجراء معايرة الأكسجين الصفرية. أثناء معايرة الهواء ، قم بإعداد محلول مخزون ثنائي ثيونيت الصوديوم الطازج عن طريق إذابة مسحوق O2-Zero في مخزن مؤقت من الفوسفات 50 ملليمولار بتركيز 2.5 ملليمولار ل SV. بعد الانتهاء من معايرة الهواء ، أغلق الغرفة. راقب إشارة الأكسجين لمدة 60 إلى 120 دقيقة تقريبا ، مما يسمح لتركيز الأكسجين بالانخفاض من تشبع الهواء إلى حوالي 150 ميكرومولار. ضع أربع علامات تحمل علامة J01 إلى J04 على مخطط منحدر الأكسجين الساالب. اختياريا ، باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بمعايرة محلول ثنائي تيونيت الصوديوم لضبط تركيز الأكسجين على 100 ميكرومولار وضبط العلامة J05. لحساب ميل خلفية الأكسجين الآلي في DatLab ، حدد Flux Slope. بعد ذلك ، افتح نافذة تصحيح خلفية الأكسجين وحدد ملف نشط كمصدر لبيانات خلفية الأكسجين. تحقق من استخدام جميع علامات J0 لحساب الانحدار الخطي. ثم انقر فوق تطبيق لتصحيح خلفية الأكسجين. للبدء ، اغسل غرف Oroboros بالماء منزوع الأيونات ، وأضف وسط MiR05 الطازج إلى الغرفة. بعد اختبار الخلفية الآلي ، افتح علامة تبويب DatLab جديدة وحدد بروتوكول SUIT-003 لتجارب الصفائح الدموية البشرية. باستخدام نظرة عامة على بروتوكول DatLab التي تظهر في الشريط الجانبي للبروتوكول، حدد محاليل المخزون الكيميائي. ثم حدد محاقن هاميلتون وفقا للمواد الكيميائية. ضع المحاقن على رف الحقنة مع الملصقات بالتسلسل وفقا لبروتوكول SUIT. لاستبدال الحجم الجزئي ، احسب الحجم V بما يعادل الحجم V الذي تمت إزالته من الحجم الفعلي في الغرفة المفتوحة ، مع مراعاة الحجم الميت الشعري. ثم قم بإزالة السدادة التي تم إدخالها بالكامل وضعها على الرف. قم بإزالة الحجم المحسوب V من MiR05 من الغرفة بناء على نوع الخلية وتركيز تعليق خلية المخزون. الآن ، قم بتعبئة حجم مكافئ لتعليق خلية المخزون بتركيز خلية معروف في الغرفة. في المقابل ، لاستبدال الحجم بالكامل ، قم بسحب الوسيط بالكامل من الغرفة. أضف 0.54 مل من مخزون الميتوكوندريا القلبية المعزولة إلى غرفة SV. أغلق الغرفة واسحب أي محلول عينة زائد من وعاء السدادة. لبدء بروتوكول معايرة المعايرة بالتحليل الحجمي لمثبط مفك اقتران الركيزة أو SUIT، افتح نافذة الحدث في DatLab لتصور أحجام المعايرة بالتحليل الحجمي. باستخدام حقنة هاميلتون الدقيقة ، قم بمعايرة محاليل المخزون الكيميائي في الغرفة. ثم قم بتعيين الحدث في DatLab. اسمح بتثبيت التدفق بعد المعايرة بالتحليل الحجمي. لتحليل البيانات ، ضع علامة على الجزء التمثيلي والمستقر من المؤامرة. كان تدفق الأكسجين في الخلفية عند تشبع الهواء أعلى بمقدار 3.9 مرة في غرفة 0.5 مليلتر مقارنة بغرفة 2.0 مليلتر ، بما يتفق مع الفرق المتوقع نظريا بأربعة أضعاف في تدفق الأكسجين في الخلفية النوعي للحجم. كان تباين تدفقات الخلفية الآلية متطابقا تقريبا في مجلدي الغرفة. كانت معدلات التنفس للصفائح الدموية الحية ، والخلايا الليفية المنفذة ، والميتوكوندريا المعزولة مرتبطة ارتباطا وثيقا في كلا النوعين من الغرف عند تطبيق تصحيح الخلفية المناسب. استقر تدفق الأكسجين بشكل أسرع في غرفة المليلتر مقارنة بغرفة 0.5 مليلتر بعد إعادة الأكسجين. كان استهلاك الأكسجين المتبقي بعد تثبيط المركب الثالث متسقا بين الغرفتين ، متماشيا مع حد الكشف الآلي.