يناير 24, 2025
يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة واقتصادية لتقييم فعالية المحسسات الضوئية المحتملة في التعطيل الضوئي الديناميكي المضاد للبكتيريا (aPDI) ، باستخدام تنسيق لوحة 96 بئرا جنبا إلى جنب مع مصدر ضوء لوحة LED. يتيح هذا النهج الاختبار المتزامن لظروف تجريبية متعددة ، بما في ذلك التركيزات والمركبات المختلفة والسلالات البكتيرية.
يركز بحثي على استكشاف جزيئات مختلفة من عائلة مركبات الفلافيليوم الطبيعية والاصطناعية على حد سواء مع اهتمام أساسي بدراسة نشاطها الحيوي في سياق الحماية من الضوء للأشعة فوق البنفسجية وتقييم إمكاناتها كمحسسات للضوء لتطبيقات العلاج الضوئي. أظهرت النتائج الحديثة في مجموعتنا البحثية الخصائص المنشطة للضوء لأصباغ الفلافيليوم القائمة على الأمين، مما أثبتها كفئة جديدة واعدة من المحسسات للضوء. تظهر هذه المركبات إمكانات كبيرة لمزيد من الاستكشاف ، مما يمهد الطريق لتطبيقات مبتكرة في هذا المجال.
باستخدام نظام الصفيحة الدقيقة واللوحة الضوئية ذات 96 بئرا ، يمكننا الحصول على فحص عالي الإنتاجية للحساسات الضوئية في بيئة خاضعة للرقابة ، مما يبسط تحديد المرشحين المختلفين للعلاج الضوئي والمقارنة بينهما. للبدء ، أدخل بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية على صفيحة أجار مولر هينتون من ثقافة التوقف. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للحصول على ثقافة جديدة.
اجمع مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات جديدة من صفيحة الأجار وقم بتخفيفها في ستة ملليلتر من PBS المعقم المفلتر مسبقا عند درجة الحموضة 7.4. دوامة اللقاح عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى أربع دورات لتجانس العينة وسحب ثلاثة ملليلتر من اللقاح المتجانس إلى كوفيت يمكن التخلص منه. بعد قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر ، قم بتخفيف العينة لتتناسب مع الكثافة البصرية البالغة 0.1 باستخدام PBS.
قم بإعداد محلول مخزون لمركب المحسس الضوئي في مذيب مناسب مثل DMSO أو PBS. قم بتخفيف محلول المخزون في PBS لإنشاء حل العمل ، مما يضمن عدم تداخل مكونات وسائط الثقافة البكتيرية مع امتصاص الضوء. دوامة الحل العملي لضمان التجانس الكامل.
للبدء ، قم بإعداد تعليق المكورات العنقودية الذهبية وحل العمل المركب للحساسات الضوئية. قم بإعداد لوحين منفصلين بسعة 96 بئرا ، أحدهما مخصص للتعرض للضوء والآخر للتحكم في الظلام. في كل لوحة ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر لكل من محلول التحسس الضوئي والتعليق البكتيري.
امزج المحاليل من 5 إلى 10 مرات باستخدام الماصة. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للمحسس للضوء بالتفاعل مع الخلايا البكتيرية. بعد الحضانة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة.
حافظ على حماية إحدى اللوحات من التعرض للضوء كتحكم في الظلام. ضع اللوحة الأخرى المكونة من 96 بئرا فوق لوحة LED المستطيلة 50 واط. ضع علامة على حواف اللوحة على سطح LED لضمان وضع ثابت عبر تكرار البروتوكول.
قم بتعريض اللوحة لضوء LED لمدة 15 دقيقة تقريبا. استخدم لوحا آخر من 96 بئرا لإعداد التخفيفات التسلسلية للعينات ، بما في ذلك الآبار الضابطة وغير المشعة والمشععة. أضف 180 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر ، وفقا لعدد العينات.
Aliquot 20 ميكرولترا من كل بئر في الألواح المشعة وغير المشعة في العمود الأول من اللوحة المملوءة ب PBS. باستخدام ماصة صغيرة متعددة القنوات، قم بإجراء تخفيف تسلسلي بسيط من البئر 1 إلى 6. قسم لوحة أجار إلى ستة أقسام متساوية مع كل قسم يتوافق مع أحد التخفيفات.
Aliquot 10 ميكرولتر من كل بئر على القسم المقابل من لوحة أجار. احتضن الطبق لمدة 18 إلى 20 ساعة. قم بإزالة لوحة أجار من الحاضنة وتحديد المناطق المناسبة لعد المستعمرات.
داخل كل قسم من لوحة المثقاب ، احسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة. أظهر طيف نطاق الضوء المرئي ثلاث قمم مميزة بين 400 و 700 نانومتر. في ظل الظروف المظلمة ، لم تظهر أي من مركبات الفلافيليوم المختبرة تأثيرات سامة للخلايا.
في المقابل ، بعد التعرض للضوء ، تسببت المركبات المختبرة في انخفاض يعتمد على الجرعة في صلاحية المكورات العنقودية الذهبية مع تأثيرات كبيرة لوحظت عند تركيزات 6 و 12 ميكرومولار.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
يحدد هذا البروتوكول طريقة اقتصادية لتقييم فعالية المحسسات الضوئية في التعطيل الضوئي الضوئي المضاد للبكتيريا (aPDI) باستخدام صيغة لوحة 96 بئرًا مع لوحة LED. تسمح هذه التقنية بالتقييم المتزامن لظروف تجريبية مختلفة، بما في ذلك تركيزات مختلفة، ومركبات، وسلالات بكتيرية.
High-throughput LED-based in vitro screening enables rapid assessment of photoactivable molecules for antibacterial photodynamic inactivation, addressing urgent needs in antibiotic resistance. This platform supports early-stage triage of photosensitizer candidates by providing standardized, reproducible, and quantitative viability data. Integrating such screening into discovery pipelines accelerates identification of promising compounds for further translational development.
This LED-based screening method fits at the interface of early discovery and lead identification for antibacterial photodynamic agents.