تحديد مواقع تكامل الفيروسات العدسية ذات الصلة وظيفيا في مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية

نحن نجري أبحاثا في علم الجينوم الوظيفي مع التركيز على تحديد وتوصيف العناصر الوظيفية داخل الجينوم البشري. ينصب اهتمامنا الرئيسي على استكشاف جزء الجينوم الذي لم يتم تخصيصه جيدا بعد لفهم أدوارهم المحتملة بشكل أفضل وكيف يمكن أن يساهمون في علم الأحياء البشري والأمراض. تحتوي أدوات علم الوراثة العكسي الحالية على بعض القيود ، مثل التأثيرات غير المحددة والتكلفة العالية في إنشاء مكتبات معقدة من مباحث أمن الدولة أو SGIs.

التحدي الآخر هو أن هذه الطريقة قد تستهدف فقط العناصر الجينومية المخصصة ، مما يترك جزءا كبيرا من الجينوم غير مستكشف. يقدم البروتوكول الذي تم تطويره هنا نهجا جديدا لتحديد العناصر الجينومية غير المعروفة سابقا ، بما في ذلك exons الوظيفية الجديدة في كل من ترميز البروتين وعيون الترميز الطويلة. للبدء ، استخدم الحمض النووي الجيني المعزول من مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على الفيروسات العدسية كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل الخطي في تفاعل 50 ميكرولتر. ثم.

أضف الكواشف الأخرى المطلوبة الموضحة هنا في أنبوب PCR. قم بإجراء 50 دورة من PCR الخطي في جهاز تدوير حراري قياسي في ظل ظروف PCR المحددة. انقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي جديد نظيف سعة 1.5 مل.

امزج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل جيدا مع 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي البيوتين والستربتافيدين واحتضان الخليط لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، مع رجها عند 400 دورة في الدقيقة في حمام معدني. ثم استخدم حاملا مغناطيسيا لجمع الخرزات وإزالة المادة الطافية بعناية. اغسل الخرزات ب 300 ميكرولتر من الربط أو المخزن المؤقت للغسيل ست مرات ، وتخلص من المادة الطافية بعد كل غسلة.

بالنسبة لتخليق الخيط الثاني ، أعد تعليق الخرزات في حجم تفاعل 24 ميكرولتر يحتوي على مخزن مؤقت لجزء Klenow ، وخليط DNTP ، وبرايمر P5N6 في أنبوب PCR. قم باحتضان الخليط مسبقا عند 15 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز تدوير حراري PCR ، ثم أضف وحدتين من جزء Klenow إلى خليط التفاعل. احتضان الخلائط في جهاز التدوير الحراري PCR في ظل الظروف المحددة.

بعد ذلك ، قم بنقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي جديد نظيف سعة 1.5 مل. استخدم حاملا مغناطيسيا لالتقاط الخرزات والتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخرزات برفق باستخدام 300 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من DNase و RNase عند أربع درجات مئوية.

اجمع الخرزات وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخرزات في حجم تفاعل PCR سعة 25 ميكرولتر يحتوي على Taq buffer و Taq DNA polymerase و primer P5 وخليط DNTP و primer 3-LTR_Nest في أنبوب PCR. قم بإجراء PCR في جهاز تدوير حراري باستخدام الإعدادات الموضحة هنا.

استخدم خمسة ميكرولترات من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل كقالب للجولة التالية من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام التمهيدي Illumina P5 والبرايمر Illumina P73-LTR. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز التدوير الحراري في ظل الظروف المحددة. بعد ذلك ، انقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل.

بعد موازنة الخرزات من درجتين إلى ثماني درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، اخلطي الخرزات جيدا عن طريق قلبها أو دوامها. الماصة 1.2 ضعف حجم الخرزات في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 ملليلتر. أضف منتجات PCR إلى الخرزات واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.

احتضان الخرزات للسماح للحمض النووي بالارتباط بها. بعد ذلك ، ضع العينات على حامل مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن يصبح المحلول صافيا. الآن ، اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية وقم بإزالة المادة الطافية. جفف الخرزات بالهواء في درجة حرارة الغرفة مع فتح الغطاء لمدة خمس دقائق تقريبا. الآن ، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي.

أضف 22 ميكرولترا من الماء المقطر الخالي من DNase و RNase. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيا.

بعد ذلك ، انقل 21 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل. لقياس التركيز باستخدام مقياس الفلور ، قم بإعداد محلول العمل عن طريق خلط الكاشف والمخزن المؤقت بنسبة واحد إلى 200. امزج 10 ميكرولتر من المعيار واحد و 10 ميكرولتر من المعيار الثاني ، لكل منهما 190 ميكرولتر من محلول العمل ، لإعداد معايير الفحص.

قم بتدوير الخلطات برفق لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان. بعد ذلك ، قم بإعداد عينة الفحص عن طريق خلط ميكرولتر واحد من منتجات PCR المنقاة مع 199 ميكرولتر من محلول العمل. دوامة الخليط برفق لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان.

احتضان معايير الفحص وعينات الفحص لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، مع إبقائها محمية من الضوء ، ثم قم بتشغيل مقياس الفلور. حدد برنامج مقايسة الحمض النووي عالي الحساسية مزدوجة الشريطة من القائمة الرئيسية. للمعايرة، أدخل الوحدة القياسية في الماكينة واضغط على زر القراءة القياسي لقياس المعيار الأول.

ثم أدخل المعيار الثاني واضغط على زر القراءة القياسي لقياس المعيار الثاني. لقياس العينة، اضغط على زر تشغيل العينات للانتقال إلى صفحة قياس العينة. أدخل كل أنبوب يحتوي على عينة الفحص واضغط على زر أنبوب القراءة للحصول على التركيز.

في العينة منخفضة الجودة ، تشير الذروة المهيمنة حول 83 زوجا أساسيا إلى تلوث ثنائي المحول. في المقابل ، تعرض مكتبة NGS عالية الجودة قمما رئيسية بين 150 و 1,500 زوج أساسي ، مما يعكس ملف تعريف المكتبة الناجحة.