الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 باستخدام خلايا HeLa والكيمياء الخلوية المناعية باستخدام المجهر الضوئي

الغرض الرئيسي من التجربة التالية هو استخدام الكيمياء المناعية للكشف عن الأجسام المضادة ل MDA5. يتم ذلك عن طريق استخدام خلايا HeLa ثم نقل خلية HeLa ببناء MDA5. على هذا النحو ، ستنتج خلايا HeLa بروتينات MDA5 التي يمكن ربطها بالأجسام المضادة MDA5.

بعد تضمين خلية HeLa مع بنية MDA5 ، يتم استخدام كاشف Triton لاختراق غشاء خلايا HeLa ، مما يسمح بمرور الأجسام المضادة المضادة ل MDA5. بعد ذلك ، يتم إضافة مصل المريض الذي يحتوي على الأجسام المضادة المضادة ل MDA5. ثم ترتبط الأجسام المضادة المضادة ل MDA5 ببروتينات MDA5 داخل خلايا HeLa.

بعد ذلك ، يتم نشر الأجسام المضادة الثانوية ، التي يرتبط بها بيروكسيداز الفجل ، في الخلايا ، ثم ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالأجسام المضادة المضادة ل MDA5. أخيرا ، يضاف الكروموجين إلى الخلايا ويتأكسد في وجود أجسام مضادة ثانوية مترافقة بالفجل الحار بيروكسيداز ، مما ينتج عنه لون مرئي تحت المجهر الضوئي. ستظهر النتيجة الإيجابية شيئا مثل الصورة أعلاه.

في عرض الفيديو اليوم ، نتدفق إلى مجال حاسم من البحث الطبي ، وهو الكشف عن الأجسام المضادة للجين الخامس المرتبط بالتمايز الميلانيني ، وتسمى أيضا الأجسام المضادة المضادة ل MDA5. تلعب هذه الأجسام المضادة الذاتية دورا مهما في مؤشر التشخيص البسيط للمرضى الذين يعانون من أمراض الرئة الخلالية ، وخاصة أولئك الذين يعانون من تقدم سريع تكمن أهمية هذا البحث في تأثيره المحتمل على نتائج المرضى. يعد الاكتشاف المبكر والدقيق للأجسام المضادة الذاتية MDA5 أمرا حيويا للإدارة الفعالة لمرض المناعة الذاتية الحاد هذا.

الميزة الأساسية للطريقة التي أظهرناها على الطريقة الذهبية لفحص الجسم المضاد الذاتي المضاد ل MDA5 هي أنه يمكن القيام به بشكل أسرع وتوفير الوقت والجهد مقارنة بمقايسة الزيارة المناعية التقليدية المسماة بالراديو. تسمح لنا هذه الكفاءة المتزايدة بمعالجة المزيد من العينات وتوليد النتائج بسرعة. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان ملاحظة أن طريقتنا لا توفر كفاءة فائقة فحسب ، بل توفر أيضا نفسها في السلامة والفعالية من حيث التكلفة عند مقارنتها بمقايسة الترسيب المناعي الانتقالي.

الآن ، دعونا نرى كيف يتم ذلك. سيقود مساعدي الباحث ، تيو كاي فا الإجراء. حافظ على خلايا HeLa باستخدام Modified Eagle's Medium من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني ، و 1٪ مضاد للفطريات الحيوية عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2.

امرر الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام ، أو عندما تصل الخلايا إلى 90 إلى 100٪ من التقاء القيا. اجلس 70،000 خلية هيلا على كل بئر قبالة صفيحة 24 بئر. 24 ساعات قبل تعدي, وصافي الخلايا, أي تقريبا 90٪ التقاء

قم بتخفيف 500 نانوجرام من البلازمين و 1.5 ميكرولتر من كاشف التعداء لكل منهما في 25 ميكرولتر من وسط المصل المخفض. أضف الحمض النووي المخفف ، وقم بعمل كاشف تعداء مخفف بنسبة واحد إلى واحد. تخلط جيدا وتحتضن لمدة خمس دقائق.

أضف الخليط إلى الخلايا الجالسة قبل يوم واحد وحركه لخلط مركب دهون الحمض النووي على الفور. تأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 80 إلى 90٪. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نصف الكرة المبلل بنسبة 5٪ CO2 ، من 40 إلى أربع ساعات ، وانتقل إلى الكيمياء المناعية.

نحن نستخدم عاملا متاحا تجاريا. يمكن العثور على مزيد من المعلومات في جدول المواد. فعاليتها في التعداء هي 50٪ يمكن تحديد نجاح تعداء البروتين المستهدف والتعبير عنه عن طريق نقل الخلايا بالبروتين المجمد الذي يعبر عن البلازميد وإجراء الدم الغربي لتصور التعبير عن البروتين المستهدف بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة أي وسائط متبقية.

يمكن إجراء الغسيل عن طريق هز اللوحة أو شاكر مداري. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالديهايد في PBS تحذير. بارافورمالديهايد سام.

استخدم إرشادات المناولة المناسبة. اترك الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تخلص من الكاشف المثبت.

استخدم PBS لغسل الخلية مرتين. ضع كاشف تريتون ثم اترك الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدمنا Triton X 400 في PBS بتركيز 0.3٪ بعد 10 دقائق ، تخلص من كاشف Triton.

أضف PBS لغسل الخلايا مرة واحدة. الخطوة التالية ، قم بإجراء الحظر باستخدام مصل أبقار الجنين بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني واترك الخلايا لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة الكاشف المانع. ثم أضف PBS لغسل الخلايا مرة واحدة.

أضف بلازما المريض المخففة إلى الخلايا. تأكد من تخفيف بلازما المريض بنسبة واحد إلى 5,000 تخفيف في برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام. اضبط التخفيف لتحسين الإشارة أو تقليل الخلفية حسب الحاجة لضمان نتائج غير متحيزة.

أجرى الموظفون الاختبار ، ولم يكن لديهم معرفة بالعينات التي تخص المرضى وأيها من أفراد أصحاء. احتضان عينة عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة عينة المريض وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.

عالج الخلايا مع الماعز المخفف الفجل بيروكسيداز ، IgG المضاد للإنسان بنسبة واحد إلى 250 تخفيفا في برنامج تلفزيوني. اترك الخلايا لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة ، تخلص من الجسم المضاد الثانوي.

اشطفه باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد غسل الخلايا ، قم بتلطيخ الخلايا بمحلول عمل 300 ميكرولتر DAB لكل بئر. يتم تحضير محلول العمل DAB عن طريق فقدان تركيز تعزيز DAB ، ومخفف DAB باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

بعد تلطيخ الخلية لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة الصبغة. بعد إزالة الصبغة ، اشطفها بالماء المقطر المتأين ورجها لمدة خمس دقائق. قم بتلطيخ نواة الخلية بالسموم الدموية المخففة.

نحن نستخدم السموم الدموية في مثل أ ، في 10 أضعاف تخفيف. انتظر لمدة خمس دقائق لعملية التلوين. بعد خمس دقائق ، تخلص من السموم الدموية ، ثم اغسلها بالماء المقطر الذي تم تحليله مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما.

الخطوة الأخيرة ، راقب نتائج التلوين تحت المجهر الضوئي. دعونا نفسر نتائج فحص الكيمياء المناعية للأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5. نتيجة إيجابية.

تظهر الإيجابية الحقيقية صبغة بنية قوية داخل HeLa تعبر عن MDA5. هذا يؤكد الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 في عينة المريض. نتيجة سلبية.

تظهر النتيجة السلبية خلايا HeLa بدون تلطيخ بني ، مما يشير إلى عدم وجود أجسام مضادة ذاتية مضادة ل MDA5. نتيجة إيجابية خاطئة. بشكل حاسم ، تظهر الإيجابية الكاذبة تلطيخا بنيا واسعا في جميع الخلايا ، بغض النظر عن تعبير MDA5s.

يجب تمييز هذا التلوين غير المحدد الذي يظهر في حالات المناعة الذاتية عن الإيجابية الحقيقية لتجنب التشخيص الخاطئ. توفر طريقتنا طريقة أسرع وأكثر أمانا وفعالية من حيث التكلفة للكشف عن الأجسام المضادة للأعضاء المضادة ل MDA5. هذا لديه القدرة على التأثير بشكل كبير على نتائج المرضى في إدارة أمراض الرئة الخلالية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قد تعلمت كيفية إجراء الكيمياء المناعية وكيفية تحديد السريرية ذات الصلة في نتائج الاختبار.