تحليل نشاط الخلايا التائية البشرية في بيئة الزراعة المشتركة الخيفية للخلايا السرطانية المعالجة مسبقا

تغير الخلايا السرطانية النمط الظاهري المناعي أثناء العلاج ، مما قد يؤثر على النتيجة ، وبالتالي فإن الهدف من بحثنا هو التحقيق في التفاعل بين الخلايا التائية والخلايا السرطانية لخلق فهم أفضل لتلك التفاعلات.

تعزيز الحساسية الإشعاعية ، خاصة في الأورام المقاومة للإشعاع من خلال الجمع بين العلاج الإشعاعي ومثبطات الكيناز. يعد استهداف استجابة تلف الحمض النووي حاليا جزءا أساسيا من التطورات الأخيرة. يتم حاليا إنشاء نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ونماذج الزراعة المشتركة في مجال البيولوجيا الإشعاعية لزيادة قابلية المقارنة بين البيانات في المختبر وفي الجسم الحي.

[الراوي] للبدء ، احصل على الخلايا السرطانية HSC4 بحجم مناسب من وسط D10. قم بزرع ثلاثة آبار على الأقل لكل حالة ، يحتوي كل منها على 15,000 خلية في 200 ميكرولتر من الوسط في 96 لوحة بئر. قم بتعيين صفيحة واحدة لمعالجة العينة ، بما في ذلك الآبار للخلايا السرطانية فقط والتحكم في الخلايا التائية فقط والآبار لعد الخلايا لكل علاج في يوم الزراعة المشتركة. في اليوم الثاني ، عالج الخلايا السرطانية بمثبطات كيناز بالتركيزات المطلوبة. قم بإشعاع صفيحة واحدة بعد ثلاث إلى أربع ساعات ونفس الشيء بعد 24 ساعة من الحضانة مع خمسة رمادي للإشعاع المجزأ. بالنسبة لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، أو عزل PBMC ، قم بنقل الدم المختلط EDTA الذي تم جمعه من متبرع سليم إلى أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 ملليلترا. املأ كلا أنابيب الطرد المركزي حتى 50 مل ب PBS و 2٪ FBS. بعد ذلك ، قم بإعداد ستة أنابيب طرد مركزي مع تطعيمات بلاستيكية لفصل PBMC. املأ كل منها ب 15 مل من وسط التدرج الكثافة الباردة. قم بتراكب وسائط تدرج الكثافة بعناية ب 12 إلى 15 مل من الدم المخفف. الطرد المركزي للأنابيب عند 1,200 جم لمدة 10 دقائق دون تباطؤ. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل المادة الطافية إلى أربعة أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 50 مل. تخلص من الأنابيب المستخدمة. املأ أنابيب الطرد المركزي الجديدة حتى 50 مل ب PBS و 2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 120 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص بعناية من المادة الطافية أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من PBS تحتوي على 2٪ FBS وادمج الكريات في أنبوب صقر واحد. املأ أنبوب الطرد المركزي إلى 50 مل مرة أخرى باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS. جهاز الطرد المركزي PBMCs عند 300 جم لمدة 10 دقائق. تخلص بعناية من المادة الطافية أعد تعليق حبيبات الخلية في 80 ميكرولتر من MACS بالإضافة إلى المخزن المؤقت لكل 10 إلى قوة سبع خلايا. أضف 20 ميكرولترا من ميكروبيدات CD8 لكل 10 إلى قوة سبع خلايا واخلطها بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احتضن لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بملليلترين من MACS بالإضافة إلى المخزن المؤقت لكل 10 إلى قوة سبع خلايا. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 1000 ميكرولتر من MACS بالإضافة إلى المخزن المؤقت. ضع عمودين MS في المغناطيس وضع أنبوبين للطرد المركزي سعة 15 ملليلتر تحتهما. قم بموازنة الأعمدة بسعة 500 ميكرولتر من MACS بالإضافة إلى المخزن المؤقت. ثم قم بتحميل حجم متساو من تعليق الخلية في عمود MS المعد. اشطف الأعمدة ب 500 ميكرولتر من MACS بالإضافة إلى المخزن المؤقت ثلاث مرات. قم بتسمية الخلايا النهائية التي تم جمعها على أنها تدفق من خلال أو CD8 سلبية ودمجها في أنبوب طرد مركزي واحد. ثم خذ أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلتر يسمى خلايا تائية موجبة CD8. اغسل كلا العمودين اللذين يحتويان على خلايا CD8 موجبة مغناطيسية ب 1000 ميكرولتر من MACS بالإضافة إلى مخزن مؤقت لكل منهما. قبل تلطيخ الخلايا التائية ، قم بطردها عند 300 جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1000 ميكرولتر من PBS. الطرد المركزي التعليق مرة أخرى عند 300 غرام لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 2000 ميكرولتر من محلول تلطيخ CFSE ميكرومولار. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا الملطخة عند 300 جم لمدة خمس دقائق. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، أعد تعليقها في وسط الخلايا التائية. بذر الخلايا في CD3 و CD28 المغلفة بستة ألواح جيدا واحتضنها. في اليوم الرابع ، احصد الخلايا التائية وأعد تعليقها في وسطها الخاص. أضف العدد المطلوب من الخلايا التائية إلى آبار الخلايا السرطانية بنسبة واحد إلى واحد بعد عد الآبار المخصصة. في اليوم السابع ، قم بإزالة لوحة الثقافة من الحاضنة لتقدير تكاثر الخلايا التائية. بعد غسل الخلايا ، قم بلطخها بالأجسام المضادة المرغوبة وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي لتقييم الخلايا التائية. استبعاد السكان المزدوجين استنادا إلى منطقة التشتت الأمامية مقابل ارتفاع التشتت الأمامي للحصول على المفردات. ارسم المفردات لتحديد الخلايا التائية بناء على منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية. ارسم تعبير CD3 مقابل منطقة التشتت الجانبية للتمييز بين الخلايا التائية. علاوة على ذلك ، حدد الخلايا التائية الموجبة CD8 بعد رسم إشارة CD8 مقابل منطقة التشتت الجانبية. يجب أن تعبر جميع الخلايا التائية عن CD3 و CD8. ارسم إشارة CFSE لجميع الخلايا التائية الموجبة CD8 كرسم بياني. بعد الانتهاء من خطوات البوابات ، حدد الخلايا التائية الموجبة CD8 كمدخلات وقم بتحليل تعبير النمط الإسوي CD25 أو HLA-DR عن طريق رسم مضان علامة السطح المعنية مقابل منطقة التشتت الجانبية. زادت نسبة الخلايا التائية التكاثرية عند زراعتها مع الخلايا السرطانية HSC4 المشععة. عزز العلاج الإشعاعي أو RT و RT بالإضافة إلى تثبيط ATR بشكل كبير تكاثر الخلايا التائية مقارنة ب RT بالإضافة إلى تثبيط ATM. من بين الخلايا التائية عالية التكاثر ، كان تثبيط RT بالإضافة إلى ATR هو الأكثر فعالية في تحفيز الانتشار. تم تقليل تنظيم التعبير عن CD25 على الخلايا التائية بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية HSC4 المعالجة بتقنية RT. أدت المعالجة المسبقة للخلايا السرطانية باستخدام مثبط ATM وحده إلى انخفاض كبير في تعبير CD25 مقارنة بمثبط ATR. أدى الجمع بين مثبطات RT و ATM إلى زيادة تعبير CD25 مقارنة بمثبطات RT بالإضافة إلى ATR. تم تنظيم تعبير HLA-DR على الخلايا التائية بشكل عام بواسطة RT. الزراعة المشتركة مع خلايا HSC4 المعالجة مسبقا بمثبط RT بالإضافة إلى مثبط ATR زاد من تعبير HLA-DR مقارنة ب RT وحده أو RT بالإضافة إلى مثبط ATM.