تحرير الجينوم في بعوض الحمى الصفراء الزاعجة المصرية باستخدام CRISPR-Cas9

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتحرير الجينوم من خلال الحقن المجهري الجنيني في البعوض A. aegypti باستخدام تقنية CRISPR-Cas9.

يتضمن نطاق بحثنا إنشاء خطوط بعوض معدلة وراثيا باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. استخدام تقنية CRISPR-Cas9 لقمع أعداد البعوض ، PgSIT ، وكذلك لإنشاء أنظمة التعبير الثنائي للتحكم الزمني المكاني للتعبير الجيني.

لقد حصلنا على كل من خطوط خروج المغلوب والضربة القاضية باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. تتضمن خطوط الضربة الخاصة بنا إدخال منشط QF الذي يسمح بالتحكم الزمني المكاني للجينات النهائية ، مثل علامات الفلورسنت ، و GFP ، لوضع العلامات الخاصة بالأنسجة ومراسلي النشاط العصبي ، G-CaMP6.

سيسمح إنشاء خطوط متحولة جديدة للبعوض بفهم أعمق لوظيفة الجينات والآثار العصبية والفسيولوجية والسلوكية. وقد يؤدي ذلك إلى استحداث طرق جديدة لمنع انتقال الأمراض التي ينقلها البعوض. طور مختبرنا تقنية قمع البعوض التي تعتمد على تقنية CRISPR-Cas9 للتخلص من الجينات المتعلقة بخصوبة الذكور وبقاء الإناث. أيضا ، أنشأنا العديد من خطوط البعوض لدراسة مقاومة البعوض الحسية ، وتحديدا حاسة الشم والرؤية.

[المذيع] لتحضير بنية الحقن للطفرات بالضربة القاضية ، قم بتخفيف بروتين Cas9 إلى التركيز المطلوب باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف Cas9. ثم قم بتخفيف كمية الحمض النووي الريبي المركب في المختبر أو gRNA بالماء عالي النقاء. امزج بروتين Cas9 المخفف مع كل gRNA لتشكيل مركب بروتين نووي الريبي. ثم اجمع بين المحاليل المعقدة متعددة للبروتين النووي الريبي المختلطة مسبقا. لإدخال كاسيت الجينات بوساطة الإصلاح الموجه بالتماثل ، قم بتخفيف وخلط بروتين Cas9 و gRNAs. قم بتخفيف البلازميد المتبرع بالماء عالي النقاء والجمع بين جميع البنيات. بعد ذلك ، استخدم خيوط الكوارتز لتحضير إبر الحقن المجهري. باستخدام البرنامج التالي. اسحب الإبر باستخدام مجتذب ماصة دقيقة بالليزر. بعد إعداد شفاط يدوي ، قم بترطيب أوراق الترشيح ذات الدائرة البيضاء وضعها إما على الجدار الداخلي أو فوق القطن الرطب داخل المجمع. ضع خمس إلى 10 إناث بعوض تم تغذيتها بالدم منذ خمسة إلى 10 أيام في الجامع. ثم ضع المجمع في الظلام لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة البعوض من المجمع. بعد الحضانة ، قم بإزالة أوراق الترشيح لحصاد الأجنة. حدد أجنة مرحلة ما قبل الأديم الأريمي ذات اللون الرمادي الفاتح من ورق الحصاد. انقل الأجنة المختارة بفرشاة مبللة إلى شريط لاصق على الوجهين يوضع فوق زلة الغطاء. قم بمحاذاة الأجنة بالتوازي ، مع التأكد من أنها جنبا إلى جنب مع مواجهة جميع الأطراف الخلفية للأمام بينما تظل محيطها رطبة. أثناء المحاذاة ، أضف زيت الهالوكربون 700 على الأجنة لمنع الجفاف. على الحاقن الدقيق ، قم بإعداد ضغط تعويض يبلغ 300 hectopascals وضغط حقن يبلغ 500 hectopascals. باستخدام محمل دقيق ، قم بتحميل ثلاثة ميكرولترات من بنية الحقن في إبرة. ضع زلة الغطاء مع الأجنة المحاذاة على شريحة مجهرية وضعها تحت المجهر للحقن. بعد ذلك ، قم بتأمين إبرة في حامل الإبرة باستخدام مناور دقيق بزاوية 10 درجات باتجاه الطرف الخلفي للأجنة. افتح الإبرة برفق عن طريق لمس طرفها برفق على حافة زلة الغطاء. ثم حقن الجنين ببنية البلازميد. بعد حقن بعوض الزاعجة agyptie ببنية الحقن ، استخدم مناديل خالية من النسالة يمكن التخلص منها لإزالة الزيت المحيط بالأجنة. أضف الماء منزوع الأيونات لشطف الأجنة. انقل الأجنة المغسولة إلى ورق ترشيح مبلل وضع ورق الترشيح على منديل مبلل داخل كوب سعة تسعة أونصات. ثم ضع القطن المبلل في قاع الكوب للحفاظ على الرطوبة. بعد الحفاظ على رطوبة الأجنة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام ، انقل ورق الترشيح مع الأجنة إلى ما يقرب من ثلاثة لترات من الماء منزوع الأيونات في وعاء معقم سعة ستة لتر للتفقيس. بمجرد أن تفقس يرقات G zero ، أضف طعام السمك الممزوج بالماء إلى المقلاة. فحص يرقات G zero لعلامة الفلورسنت في مرحلة اليرقات من الطور الثالث إلى الرابع. افصل اليرقات بناء على حالة الفلورسنت. حافظ على اليرقات الموجبة للفلورسنت واليرقات السالبة الفلورية في أحواض منفصلة. افصل البعوض المحقون حسب الجنس عندما يتشرنق وتعرف على الذكور من خلال حجمها الأصغر ، والفص التناسلي الأكثر بروزا ومدببا ، والمجدايف الأوسع. تعرف على الإناث من خلال حجمها الأكبر ، والفص التناسلي الأقل وضوحا ، والمجاذيف الضيقة. بعد تجميع البعوض الموجب للفلورسنت أو البعوض الفلوري السالب من كل جنس ، تعبر كل بركة مع بعوض من الجنس الآخر من النوع البري سلالة ليفربول A. agyptie بنسبة ثلاثة إلى خمسة أفراد من النوع البري لكل فرد تم فحصه من الفلورسنت ، مما يسمح لهم بالتزاوج لمدة أربعة أيام. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام ، قم بفحص يرقات G1 بحثا عن علامة الفلورسنت في مراحل اليرقات من الثالثة إلى الرابعة.