نقل فعال للفيروسات القهقرية والتوجيه التنافسي للتحقيق في توطين الخلايا التائية بوساطة GPCR في البيئات الدقيقة المتنوعة للأنسجة

يستكشف بحثنا كيف تؤثر GPCRs على تهريب الخلايا المناعية وتحديد مواقعها عبر البيئات الدقيقة للأنسجة المختلفة. باستخدام هذا البروتوكول والبروتوكولات التكميلية الأخرى ، حدد مختبرنا محورا جاذبا كيميائيا خاصا بالأعضاء في الأنسجة المخاطية غير المعوية. الآن ، اكتشفنا كيف أن الخلايا الليمفاوية ، موطن المعدة والرئة والقصبة الهوائية والجهاز البولي يوريثان. أقدم طريقة فعالة ومحسنة لاختبار كيفية تأثير GPCRs الفردية على حركة الخلايا التائية في الجسم الحي. لقد طورنا طريقة موثوقة لإدخال هذه المستقبلات في الخلايا التائية ، والتي تسمح الآن بالمقارنة المباشرة جنبا إلى جنب في فحوصات التوجيه التنافسية. الآن بعد أن عرفنا كيف توجه GPCRs الخلايا التائية في الجسم الحي ، يمكن للباحثين ربط تعبير المستقبلات بشكل أفضل بوظيفة المناعة. هذا من شأنه أن يساعد الباحثين في علم المناعة الأساسي ، وكذلك البحوث العلاجية. باستخدام هذا النهج ، يمكننا الآن أن نسأل كيف تشارك GPCRs الأقل شهرة أو غير المميزة في توجيه الخلايا التائية إلى أنسجة معينة. يمكننا أن نتعلم كيف يمكن ضبط إشارات GPCR لعلاج السرطان أو المناعة الذاتية. يمكننا مساعدة الخلايا التائية على الوصول إلى المكان المناسب في الوقت المناسب للأساليب العلاجية.

[راوي] للبدء ، في اليوم الأول ، قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة التي يبلغ طولها 10 سم بخمسة ملليلتر من 50 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول Poly-D-Lysine المحضر في ماء معقم. احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة ، ثم اغسل الأطباق مرتين باستخدام PBS معقم بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لضمان عدم بقايا البقايا. بعد ذلك ، افصل خلايا Plat-E باستخدام مليلترين من 0.05٪ التربسين و 0.5 ملليمولار EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. لضمان بقاء الخلية باستخدام مقايسة استبعاد التربان الأزرق ، امزج حجما متساويا من تعليق الخلية مع محلول التربان الأزرق. بعد ذلك ، قم بزرع 3 ملايين خلية حية في طبق بتري لزراعة الأنسجة بطول 10 سم مع وسط Plat-E خال من المضادات الحيوية. في اليوم الثاني ، استبدل الوسط الموجود في مزارع خلايا Plat-E ب 6.5 مل من وسائط المصل المختزلة. تحضير مزيج تعداء حسب تعليمات الشركة المصنعة. لكل طبق ، امزج 45 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000 مع 210 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض في أنبوب واحد و 15 ميكروغراما من الحمض النووي مع 235 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض في أنبوب آخر. اجمع محتويات الأنابيب عن طريق سحب العاصات ثلاث إلى أربع مرات واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل التكوين المعقد. الآن ، أضيفي الخليط باتجاه قطرة إلى الأطباق واحتضنيها لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتغطية الألواح ذات 24 بئرا لتنشيط الخلايا التائية باستخدام CD28 و CD3 المضاد للفأر بمقدار 375 ميكرولتر لكل بئر من PBS. احتضن الأطباق طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في حاضنة على أربع درجات مئوية. في اليوم الثالث ، استخدم مكبس حقنة لهرس طحال الفئران المعزولة برفق على مصفاة خلية شبكية من النايلون مقاس 100 ميكرومتر موضوعة في صفيحة بستة آبار تحتوي على وسط RPMI. انقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون مقاس 40 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل للحصول على تعليق خلية واحدة. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 450 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بإجراء الاختيار السلبي المغناطيسي باستخدام مجموعة عزل CD4 T-cell للماوس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عد الخلية التائية المعزولة باستخدام عداد الخلايا. قم بطلاء الخلايا التائية في آبار تنشيط الخلايا التائية المطلية بكثافة من واحد إلى 1.5 مليون خلية لكل بئر في مليلتر واحد من وسط RPMI 10. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة لمدة 24 إلى 48 ساعة. في اليوم الرابع ، اجمع ما يقرب من 12 مل من المواد الطافية الفيروسية من الصفائح التي يبلغ طولها 10 سم في أنبوب مخروطي الشكل. استبدل الوسيط الموجود في ألواح زراعة Plat-E ب 10 ملليلتر من وسط Plat-E الخالي من المضادات الحيوية لتوليد المزيد من المواد الطافية الفيروسية للنقل الثاني في اليوم التالي. لتصفية المادة الطافية الفيروسية التي تم جمعها ، قم بتمريرها عبر مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر. أضف ثمانية ميكروغرامات لكل مليلتر من البوليبرين وتخفيف واحد إلى 100 من المخزن المؤقت HEPES إلى المادة الطافية المفلترة. قم بتدوير لوحة الخلايا التائية المكونة من 24 بئرا لمدة سبع دقائق عند 950 جم. بعد ذلك ، اجمع واحفظه بعناية دون إزاحة الخلايا التائية. لإجراء العدوى ، أضف مليلترا واحدا من المادة الطافية الفيروسية إلى كل بئر. أغلق الأطباق بغلاف بلاستيكي وقم بتدوير الألواح على حرارة 1,150 جم لمدة أربع ساعات عند 32 درجة مئوية. بعد الإصابة ، استبدل الوسائط بعناية في كل بئر بمادة طاف الخلايا التائية المحفوظة مسبقا. في اليوم السادس ، اجمع الخلايا التائية من اللوحة في أنبوب مخروطي وجهاز طرد مركزي. اغسل الحبيبات ب PBS المحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. انقل الخلايا إلى صفيحة ثقافة جديدة تحتوي على 130 وحدة لكل مليلتر من إنترلوكين الفأر -2 و 10 نانوجرام لكل مليلتر من إنترلوكين الفأر -7. احتضان الخلايا لمدة يومين على الأقل أو حتى تصل إلى مستوى التمدد المطلوب بناء على عدد الخلايا اللازمة للحقن. في اليوم الثامن ، قم بالطرد المركزي عند 450 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لتكوير الخلايا. أضف خمسة ملليلتر من Histopaque-1077 في أنبوب سعة 15 مل. أعد تعليق حبيبات الخلايا التائية في خمسة ملليلتر من PBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. ضع طبقة تعليق الخلية بعناية فوق خمسة ملليلتر من Histopaque-1077 في أنبوب الطرد المركزي. قم بالطرد المركزي للعينة عند 400 إلى 500 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن ضبط كسر أو تسارع جهاز الطرد المركزي على 0. بعد الطرد المركزي ، راقب تكوين طبقات خلايا مميزة. اجمع بعناية طبقة الواجهة التي تحتوي على الخلايا المطلوبة باستخدام ماصة ، وتجنب التلوث بالطبقات الأخرى. أظهرت الخلايا التائية المحولة GPR25 هجرة محسنة نحو hCXCL17 و mCXCL17 بالنسبة لعناصر التحكم المحولة في الحشو ، مما يتحقق من صحة تعبير المستقبلات الوظيفية. قام GPR25 بتحويل الخلايا بشكل تفضيلي إلى الأنسجة المخاطية غير المعوية ، مثل الجهاز البولي التناسلي والمعدة والقصبة الهوائية ، مع تخصيب كبير لوحظ في سبعة أسابيع ، ولكن ليس بعد أسبوع واحد من الحقن. أظهرت فحوصات التوجيه قصيرة المدى أن الخلايا التائية المحولة GPR25 تفضيلي إلى الأعضاء الغنية ب Cxcl17 ، مثل القصبة الهوائية والمعدة واللسان والمرارة والغشاء المخاطي للرحم ، بينما تفشل في التراكم في الفئران التي تعاني من نقص Cxcl17. تم تحويل الخلايا GPR25 في الغالب إلى الشعب الهوائية ، بينما تم العثور على خلايا التحكم بشكل متكرر بالقرب من الأوردة.