A - 2 لأسلوب التصوير فوتون من تدفق الدم في القشرة المخية الحديثة من خلال نافذة القحف
فبراير 25, 2008
ويمكن دراسة ديناميات القشرية تدفق الدم في الجسم الحي بواسطة الأصباغ الفلورية التصوير ديكستران تحقن في الوريد مع ذيل القوارض 2 - الفوتون المجهري. هذا الفيديو يوضح كيفية ديناميات صورة تدفق الدم في اللحاء الجديد من الفئران من خلال زجاج النافذة المغطاة إعداد الجمجمة.
تعد القدرة على تصوير الأوعية الدموية الدماغية وتسجيل ديناميكيات تدفق الدم في الدماغ السليم للقوارض الحية تقنية قوية يمكن تطبيقها على دراسة نقص تروية الدماغ أو فسيولوجيا الدماغ الطبيعية. سنوضح هنا كيفية استخدام اثنين من الفحص المجهري للصور لتصوير ديناميكيات تدفق الدم في القشرة المخية الحديثة للفئران الحية باستخدام أصباغ الفلورسنت المحقونة في الوريد الذيل. تم تطوير هذه التقنية في الأصل بواسطة David Kleinfeld في Winfred Dank.
مرحبا ، أنا ريكاردو موتا من مختبر كارلوس بورتر كايو في قسم طب الأعصاب بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس. في مقطع فيديو سابق ، أظهرنا لك طريقة زرع نافذة الجمجمة لتجارب التصوير المزمن في الجسم الحي. سنعرض لك اليوم إجراء تصوير ديناميكيات تدفق الدم في القشرة الدماغية من خلال نافذة الجمجمة.
هذا المستحضر مفيد للغاية لأنه يسمح للمرء بالتصوير بعمق داخل الدماغ باستخدام الفحص المجهري بالليزر الفوتون. لذلك دعونا نبدأ. من أجل تصوير الأوعية الدموية الدماغية ، يجب حقن عن طريق الوريد بصبغة فلورسنت.
نستخدم أصباغ دكستر المترافقة لأن دكستر يمنع الصبغة من عبور الحاجز الدموي الدماغي والتسرب من الأوعية الدموية. يتم تخدير الفئران بالفلور ، 4٪ للحث و 1.5 إلى 2٪ أثناء الحقن. بعد ذلك ، يتم تطهير الذيل بثلاث مسحات من الكحول بنسبة 70٪ بإبرة قياس 26 ، ويتم حقن 75 إلى مائة ميكرولتر من محلول 5٪ من R domine Dextran المذاب في محلول ملحي من خلال الوريد الذيل.
في منتصف الطريق على طول عمود الذيل ، يمكن تصوير الحيوانات مباشرة بعد حقن وريد الذيل حتى يفرز النرد في البول ، والذي سيتحول إلى اللون الوردي إذا كنت تستخدم صبغة الدومين ERO في حوالي ساعتين بعد حقن صبغة دكستر الفلورية ، يتم تخدير الفأر بالفلور. مرة أخرى ، 4٪ للحث ، واحد إلى 1.5٪ للتصوير. يتم توصيل الماوس بإحكام باستخدام شريط التيتانيوم بمرحلة المجهر ، والتي تحتوي على وسادة تسخين منظمة حراريا للحفاظ على دفء.
يتم وضع بعض مرهم العين للحفاظ على رطوبة العينين. يتم تنظيف زجاج غطاء نافذة الجمجمة بالكحول بنسبة 70٪. يتم وضع النافذة بالتوازي مع المستوى البؤري وتوسيطها في مجال الرؤية.
تحت الهدف الأربعة x ، من الأفضل التقاط صورة لأوعية سطح الدماغ بكاميرا رقمية. سيتم استخدام هذه الصورة كصورة مرجعية في جلسات التصوير التالية للعثور على منطقة الصورة بشكل متكرر من يوم لآخر. ثم يتم استبدال الهدف الأربعة x بغمر الماء 40 × الهدف.
بدون تحريك المسرح ، يتم التقاط الصورة الرقمية للمنظر. مرة أخرى ، يتم ضبط إحداثيات مناور المسرح عند الصفر. نحن نستخدم صورة المسح الضوئي كبرنامج للحصول على الصور.
كتب هذا في MATLAB بواسطة Tom Paul Rudo و Bernardo Sabatini في مختبر Carls Voto. نقوم بعد ذلك بتشغيل جميع المعدات الأخرى ، الليزر ، عداد الطاقة ، أنابيب مضاعف الصور ، مكبرات الصوت ، إلخ. يتم مسح مساحة النافذة المناسبة للتصوير لفترة وجيزة بتكبير منخفض للعثور على أفضل المناطق.
بمجرد تحديدها ، يتم التقاط مكدس التكبير المنخفض للمنطقة المختارة للتصوير ويتم شرح إحداثياتها XY لتسجيل ديناميكيات تدفق الدم في الأوعية الصغيرة أو الشعيرات الدموية. نستخدم عمليات مسح الخط على طول 40 ميكرون على الأقل من الوعاء محل الاهتمام. تتم عمليات المسح الفردية هذه التي تدوم ثانية واحدة باستخدام أقل قدر ممكن من طاقة الليزر ، ويتم تدوين إحداثيات وزاوية المسح.
بمجرد انتهاء جلسة التصوير ، يتم نقل إلى غرفة دافئة حيث يمكنه التعافي من التخدير. نعرض هنا كومة من مائة صورة تم التقاطها كل خمسة ميكرونات باستخدام مجهر الفوتونين من خلال نافذة قمجمة موضوعة فوق القشرة الحسية الجسدية لفأر يبلغ من العمر خمسة أشهر تم حقنه ب r Domine dextrann من خلال وريد الذيل. يظهر هذا التسلسل من الصور الشبكة المعقدة للأوعية الدموية الكبيرة والصغيرة ، بما في ذلك الشعيرات الدموية.
لقد أظهرنا لك للتو طريقة لتصور ديناميكيات تدفق الدم في الجسم الحي من خلال نافذة الجمجمة. هذه طريقة قوية للغاية لتصوير ديناميكيات تدفق الدم الدماغي في الأوعية الدموية القشرية ، على سبيل المثال ، للتحقيق في التغيرات في تدفق الدم بعد السكتة الدماغية. يمكن إجراء تخيالات متعددة في أوقات مختلفة في BULs باستخدام الحقن المتكررة في وريد الذيل لصبغة الفلورسنت.
عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في أنظف الظروف وأكثر تعقيما وأن يكون لديك يد ثابتة للغاية. حسنا ، وهذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا الفيديو تقنية تصوير ديناميكيات تدفق الدم في القشرة الجديدة للفئران الحية باستخدام التصوير المجهري ثنائي الفوتون. يتم حقن أصباغ ديكسترا الفلورية في الوريد الذيلي، مما يسمح بملاحظة الأوعية الدموية الدماغية في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التصوير الوعائي
- تقنيات الجسم الحي
الخلفية
- تصوير تدفق الدم الدماغي ضروري لفهم فسيولوجيا الدماغ.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على دراسات النقص في التروية الدماغية.
- التصوير المجهري ثنائي الفوتون يسمح بتصوير مفصل لديناميتيات تدفق الدم.
- تقوم الأصباغ الفلورية بتوفير التباين لتصوير الأوعية الدموية.
غرض الدراسة
- لإظهار تصوير ديناميكيات تدفق الدم في القشرة الجديدة.
- لعرض استخدام النافذة الجمجمية للتصوير المزمن.
- لتوفير دليل مرئي للباحثين المهتمين بهذه التقنية.
الطرق المستخدمة
- حقن أصباغ ديكسترا الفلورية في وريد الذيل للفئران.
- استخدام التصوير المجهري ثنائي الفوتون للتصوير.
- إعداد نافذة جمجميّة مغطاة بالزجاج للوصول إلى القشرة الجديدة.
- التصوير في الجسم الحي لديناميتيات تدفق الدم في القوارض الحية.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لديناميتيات تدفق الدم في القشرة الجديدة.
- إظهار فعالية إعداد النافذة الجمجمية.
- توضيح تطبيق الأصباغ الفلورية في التصوير.
- رؤى في الأوعية الدموية الدماغية وتنظيم تدفق الدم.
الاستنتاجات
- توفر هذه التقنية رؤى قيّمة في فسيولوجيا الدماغ.
- يمكن تطبيقها في دراسات مختلفة تتضمن تدفق الدم الدماغي.
- تعزز الطريقة فهمنا للنقص في التروية الدماغية والحالات ذات الصلة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
In vivo 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window enables high-resolution, quantitative assessment of cerebral microvascular dynamics in living rodents. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurovascular and neurodegenerative disease research pipelines. The method supports predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points, informing portfolio decisions for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vascular responses to experimental perturbations in disease-relevant brain regions.
- Supports functional target validation by quantifying blood flow changes in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular targets to physiological vascular outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantitative measurement of blood flow dynamics.
- Enables reproducible imaging of the same cortical region across multiple sessions for longitudinal studies.
- Supports assay standardization through controlled dye administration and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of vascular function in models of stroke, neurodegeneration, and brain tumors.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing quantitative endpoints relevant to human disease.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling robust, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a bridge between molecular target identification and functional validation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neurovascular mechanisms and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible blood flow measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of blood flow parameters across experimental groups and timepoints.
- Translational Research: Provides endpoints aligned with clinical imaging biomarkers of cerebral perfusion.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS vascular studies across therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with quantitative, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, in vivo imaging, and quantitative analysis.
- Demands access to 2-photon microscopy, image acquisition software, and animal support infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dye preparation, injection, and imaging protocols.
- Adaptation to other rodent models or brain regions may require protocol optimization.
- Imaging depth and dye clearance kinetics may limit applicability for certain experimental designs.
