طريقة جديدة وفعالة لتلطيخ ذبابة الفاكهة مضان القلب بالتقطيع بالتبريد

يستخدم مختبر البحث الخاص بي نموذج ذبابة الفاكهة لدراسة الشيخوخة واضطراب التمثيل الغذائي ، واستكشاف التغذية وممارسة الرياضة المقيدة بالوقت كتدخل لأمراض التمثيل الغذائي وعضلة القلب والنوم والشيخوخة الأخرى. يعمل التعلم الآلي و omic مع الإستراتيجية الفسيولوجية والوراثية والغذائية على تبسيط اختبار ذبابة الفاكهة باستخدام الأجهزة المطبوعة ثلاثية الأبعاد وأساليب التعلم الآلي. تتيح الكيمياء المناعية الفلورية لقلوب ذبابة الفاكهة الكشف عن البروتينات المتعددة عبر الأنماط الجينية والأعمار ، ولكنها تواجه تحديات مثل التشريح المعقد ، والحفاظ على الأنسجة ، والتصوير عالي الدقة لأنماط تعبير بروتين معينة.

هذا البروتوكول على تحسين الحفاظ على الأنسجة واختراق الأجسام المضادة ودقة التصوير ، مما يتيح تصورات أفضل لعلامات بروتين القلب. يعالج تحديات مثل التشريح المعقد ، وتلف الأنسجة ، والدقة المحدودة في طريقة تركيب القلب الكامل التقليدية. يعزز هذا البروتوكول إمكانية الوصول إلى أبحاث القلب ذبابة الفاكهة من خلال القضاء على التشريح المعقد ، وتمكين التنفيذ بيد واحدة ، وتجنب الفحص المجهري متحد البؤر المكلف ، مما يجعل التصوير عالي الدقة أكثر جدوى.

للبدء ، قم بتخدير 5 إلى 10 ذباب باستخدام حصيرة ذبابة ثاني أكسيد الكربون. ضع الذباب في مرمى البصر تحت المجهر بتكبير من 1X إلى 2X. باستخدام مقص زنبركي ، اقطع رأس الذباب ، وقص الأجنحة ، وأزل الساقين.

احتفظ بالصدر والبطن معا ، ويشار إليه باسم الجسم. باستخدام فرشاة ، ضع الجثث برفق في أنابيب 1.5 ملليلتر على الجليد حتى يتم جمع جميع المجموعات التجريبية. بعد إزالة الأنابيب من الجليد ، أضف 100 ميكرولتر من حمض رباعي الأسيتيك إيثيلين جلايكول 10 ملليمولار عند درجة الحموضة 8 إلى كل أنبوب.

تأكد من غمر جميع الأجسام ووضع الأنابيب على شاكر مداري لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة محلول حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين جلايكول والتخلص منه من الأنابيب. ماصة 100 ميكرولتر من PBS في كل أنبوب لغسل الأنسجة لمدة 10 دقائق.

ضع الأنابيب على شاكر المداري أثناء عملية الغسيل. بعد التخلص من PBS ، قم بوضع 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في محلول PBS في كل أنبوب. ضع الأنابيب على شاكر مداري عند 100 وحدة لمدة 15 دقيقة ، مع ضمان بقاء الأنسجة على اتصال بالمحلول.

ثم تخلص من محلول بارافورمالدهايد. بمجرد اكتمال الغسيل النهائي ، انقل الأجسام إلى محلول 10٪ سكروز في PBS. تأكد من ملامسة الأجسام للمحلول داخل الأنبوب.

استرجع الثلج الجاف من التخزين وحدد بضع قطع لوضعها في صينية معدنية أو بلاستيكية صغيرة. اختر صينية بأبعاد تسمح بإدخال القالب وضعها مباشرة فوق قطعة واحدة كبيرة ومسطحة من الثلج الجاف. املأ القالب الملصق بنسبة 50٪ بدرجة حرارة القطع المثلى ، أو مركب OCT ، واسكبه ببطء لتقليل الفقاعات.

باستخدام فرشاة ، ضع بعناية أجسام ذبابة الفاكهة التي تم تشريحها وتثبيتها على سطح مركب OCT داخل القالب. باستخدام الملقط ، ادفع كل جسم إلى أسفل القالب مع محاذاة الجدار الظهري للصدر والبطن بشكل عام على طول القاع. اضبط الأجسام بحيث يكون البطن مسطحا على طول الجزء السفلي من القالب.

قم بمحاذاة جميع الأجسام في أبعاد X و Y و Z للتأكد من أن كل قسم سيتضمن جميع الموضوعات في وقت واحد. تصحيح انحناء البطن ، خاصة عند الذكور ، لتسطيحه قدر الإمكان دون ثقب أو سحق الجثث. بمجرد وضع جميع الأهداف في مكانها ، ضع القالب بحيث يجلس الجزء السفلي مباشرة فوق قطعة من الثلج الجاف.

تأكد من أن مركب OCT يبدأ في التجمد عند ملامسته واستمر حتى يتم تغليف جميع الأشخاص بالكامل في القالب. بعد التجميد ، انقل القالب إلى الفريزر على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للسماح بالتجميد الكامل طوال الوقت. بمجرد التجميد الكامل ، املأ الجزء المتبقي من القالب بمركب OCT.

لإرفاق لقمة ظرف بالقالب ، ضع كمية وفيرة من مركب OCT على الكتلة. اضغط على البتة بشكل مسطح على المركب واتركها تتجمد تماما في ناظم البرد ، عادة في غضون خمس دقائق. ثم حرر بت الظرف وكتلة OCT من القالب.

ضع البتة في الظرف ، مع التأكد من بقاء الكتلة موجهة بشكل صحيح من أعلى إلى أسفل وشد مفتاح الظرف لتأمين البت. الآن ، باستخدام مقابض الضبط وعناصر التحكم في عمق الظرف ، قم بمحاذاة الكتلة مع الشفرة واضبط عرض القسم على 20 ميكرومتر أو أقل. قم بقص كل شريحة من الكتلة باستخدام حركة بطيئة ولكن متسقة ، مما يسمح للزجاج المضاد للدحرجة بالتقاط كل شريحة أثناء قطعها.

اجمع الأقسام باستخدام الشرائح الدافئة. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بإزالة مركب OCT الزائد المحيط بالأقسام. حدد حدود كل شريحة باستخدام قلم تحديد كارهة للماء للحفاظ على محاليل الغسيل والبقع محصورة في الأنسجة.

باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها دون لمس الأنسجة. بعد التخلص من الغسيل النهائي ، ضع ماصة محلول البقع الفلورية على الأنسجة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، تخلص من بقعة الفلورسنت واغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS.

بعد ذلك ، تخلص من غسل PBS النهائي ، مع ترك كمية صغيرة من المحلول على الشريحة. باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر، ضع الماصة من ثلاث إلى خمس قطرات من وسائط التثبيت على الشريحة، وتجنب التطبيق المباشر على الأنسجة. باستخدام الملقط ، ضع زلة الغطاء عند إحدى الحواف وقم بخفض الجانب الآخر تدريجيا حتى يتدفق مع الشريحة.

ختم الشرائح بطلاء الأظافر بدون نيون أو لمعان. إذا لم يكن وسط التثبيت يتصلب ، اعتمادا على بقعة الفلورسنت ، فقم بالتصوير على الفور أو تخزين الشرائح لوقت لاحق. قبل التصوير ، افحص الشرائح للتأكد من نظافتها ونظفها برفق باستخدام مناديل مناديل بمحلول 70٪ من الإيثانول في الماء.

قم بتحليل ألمع موضوعات التألق داخل التجربة لتحديد أوقات التعرض المناسبة لكل قناة مضانة. قم بمسح كل مجموعة تجريبية في عرض مباشر لجميع القنوات لتأكيد إعدادات التعرض الصحيحة. لتحقيق الاتساق، ركز على كل هدف باستخدام نفس قناة التألق والتقط صورا لجميع الأهداف.

بعد التصوير ، قم بتخزين الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية لاستعادة الصورة في المستقبل. حافظت طريقة التصوير الفلوري على السمات الرئيسية لذبابة الفاكهة ، مثل العظم والصمام والألياف الطولية والألياف المحيطية. تم التقاط هيكل أنبوب القلب بالكامل والهياكل الثانوية التفصيلية بتكبيرات مختلفة ، مع 10X للهيكل بأكمله وتكبير 40X إلى 60X يظهر تفاصيل أدق ، مثل الألياف المقلصة المحيطية وألياف التثبيت الطولية.

أظهرت الصور المجهرية الفلورية التمثيلية هياكل قلب محفوظة في ذبابة الفاكهة w1118 مع نوى ملطخة ب DAPI ، والدهون الملطخة باللون الأخضر ، والدييفات العضلية المحتوية على الأكتين ملطخة باللون الأحمر مع البالويدين. سلط تلطيخ الفالودين الضوء بشكل فعال على الألياف الطولية والمحيطية ، مما يدل على بنية خيوط الأكتين المحفوظة على الرغم من ضغوط التجميد والتقسيم. كشف تلطيخ البقع الدهنية عن تخزين الدهون الموضعي بالقرب من أنبوب القلب.