بروتوكول فعال لتقييم تعديل نشاط ERK في نماذج متلازمة نونان المبكرة لأسماك الزرد عبر الفحص المجهري الحي FRET والتألق المناعي
مايو 2, 2025
اعتلالات RASopathies هي متلازمات وراثية متعددة الأجهزة ناتجة عن فرط تنشيط مسار RAS-MAPK. تظهر المتغيرات المسببة للأمراض التي يحتمل أن تنتظر التحقق من الصحة باستمرار بينما تحد البينات قبل السريرية الضعيفة من العلاج. هنا ، نصف بروتوكولنا في الجسم الحي لاختبار مستويات تنشيط ERK المرتبطة ب RASopathy والتحقق من صحتها وتعديلها الدوائي أثناء التطور الجنيني عن طريق التصوير الحي FRET في أسماك الزرد الصحفية في سن المراهقة.
نقوم بإنشاء نموذج سمك الزرد للأمراض التطورية المعقدة، ونربط تسلسل المرضى بالجينوميات الوظيفية، لدعم تفسير المتغيرات وكذلك اختبار الأدوية قبل السريري. على الرغم من تحسن حساسات FRET، لا تزال الاختبارات القوية في الجسم الحي التي تكتشف التغيرات الممرضة الطفيفة في إشارات Ras-MAPK مع حساسية مكانية وزمنية كافية تفتقر إلى النتائج. للبدء، ضع لوحة الحقن المجهرية المخصصة التي تحتوي على 2٪ أجاروز مصبوب في وسط E3 على منصة عمل.
رتب ومحاذاة بيض سمك الزرد المراهق المخصب في الطبق مع المسارات المناسبة لتقييد حركة البيض أثناء الحقن الدقيق. قم بتحميل الإبرة مرة أخرى باستخدام ميكرولترين من مادة الحقن باستخدام ماصة محمل دقيق. قم بضبط إعدادات الضغط والوقت لمعايرة كل حقنة بناء على جودة الإبرة والجنين في جهاز الحقن الدقيق.
حقن المحلول في مرحلة الخلية الواحدة في أجنة أسماك الزرد المراهقة. تربية أجنة مراهقة محقن في بيئة رعاية محكمة. نظف أي بيض يبدو عكما أو متدهورا خلال ثلاث ساعات من الترسب.
بعد حوالي أربع ساعات من التخصيب، باستخدام مجهر ستيريو فلوري قياسي، مضبوط على نطاق أطوال موجية يتراوح بين 465 إلى 500 نانومتر. فحص الأجنة بحثا عن تعبير مراسل الفلورة. اختر الأسماك المراهقة الإيجابية لتصوير FRET واحتفظ بالأشقاء السلبيين لإجراء تقييمات الهيستوكيميائية المناعية.
ضع برك الأجنة بنفس العدد في آبار مختلفة من صفيحة مكونة من ستة آبار. لبدء العلاج، يغمر الأجنة في ثلاثة ملليلتر من وسط E3 يحتوي على التحكم في المركبات على شكل DMSO أو MEK مخفف بتركيز مطلوب. للبدء، قم بإذابة الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ إلى 2٪ في خلاط حرارة عند 50 درجة مئوية.
بعد الذوبان، خفض درجة الحرارة إلى حوالي 30 درجة مئوية. ضع جنينا مصابا للمراهقين محقن في مركز طبق زجاجي مقاس 35 ملم للتصوير الحي. أزل الوسط الزائد من E3، وأضف قطرة من الأجاروز منخفض الذوبان لتثبيت الجنين.
دع الأغاروز يبلمر في درجة حرارة الغرفة. شغل وحدة تحكم الحاضنة قبل ساعة على الأقل من الاقتناء وضبط درجة الحرارة على 28 درجة مئوية للحفاظ على صحة الجنين. بمجرد استقرار الحاضنة، ضع طبق التصوير مع الجنين على حامل العينة واستخدم هدفا جافا بحجم 10 مرات لرؤية العينة.
شغل ليزر الأيون الأرجون واضبط قدرة الليزر إلى 50٪ في إعدادات الأجهزة، اختر دقة عمق ثمانية بت لالتقاط الصور. بعد ذلك، في لوحة الاستحواذ، اختر وضع الكشف الطيفي xy، غاما، لامبدا، z، واضبط صورة التنسيق على 512 في 512 بكسل، وسرعة مسح 400 هرتز، وتكبير بصري 0.75. فعل خط الليزر 458 نانومتر لليزر أيون الأرجون، واضبط قيمة شدته على 8.5٪. ثم اختر كاشفا هجينا وضبط حساسيته على قيمة كسب 500.
افتح القائمة المنسدلة في شريط الكاشف لاختيار بروتين فلورة السماوية أو منحنى انبعاث ECFP. لعرض منحنى انبعاث YPET، قم بتفعيل كاشف ثان. ثم اختر منحنى انبعاث YFP لبروتين الفلورة الأصفر.
لبدء عمليات الاقتراض الحية، ضع مؤشر الكشف في نطاق أكثر إشارة YFP شدة لعرض العينة. اضبط موضع البداية والنهاية لسماكة العينة في نافذة Z-Stack LASX. اضبط خصائص نطاق مسح غاما لتبدأ عند 460 نانومتر وتنتهي عند 570 نانومتر من نطاق الكشف.
حدد عرض النطاق الترددي للكشف بأنه خمسة نانومترات وحجم خطوة المسح بخمسة نانومتر. ابدأ في استحواذ z-stack. أدرج وحفظ الطيف المرجعي المعدلين ل CFP و YFP في قاعدة بيانات الصبغة المتاحة في نافذة التكوين لاستبعاد التسرب الطيفي.
اختر ملف الصورة الطيفية الناتج من جلسة التصوير وافتح نافذة العملية. بعد ذلك، في أداة فصل الصبغات، اختر فصل الصبغة الطيفية، وقم بضبط الإعدادات الخاصة بفصل الصبغة. في قوائم المنسدلة على الجانب الأيسر من الحوار، اختر طيف انبعاثات CFP الجديد في الموضع الأول وطيف انبعاثات YFP الجديد من قاعدة بيانات الطيف.
في مسح غاما للصور، حدد الصورة ذات أعلى شدة إشارة. ثم تحرك على طول z-scan لاختيار القسم البصري الذي يبرز منطقة الاهتمام على منطقة الهامش. قم بتفعيل وضع اختيار العائد على الاستثمار في منطقة الهامش من عمود لتحديد المنطقة التي تحتوي على أفضل طيف.
انقر على مؤشر العائد على العائد في نافذة العرض وعدل حجم العائد المرجعي إلى 40 فوكسل في منطقة القياسات. افتح الملف الجديد الذي يحتوي على القناتين المنفصلتين. إنتاج صورة إسقاط ثنائية الأبعاد من سلسلة الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام الإسقاط القصوى الشدة.
في نافذة العملية، اختر القص لفصل القنوات إلى ملفين منفصلين، القناة الأولى والقناة الثانية. في نافذة العملية، اختر دمج الصور، ثم اختر القناة الثانية وأدخلها في الخيار الأول. ثم اختر القناة الأولى وأدخلها في الخيار الثاني.
حدد إعادة تدرج بعامل خمسة واختر عملية النسبة. انقر على تطبيق لإنشاء ملف جديد يحتوي على صورة مقياس النسبة. احفظ الملف لتحليل البيانات.
استيراد ملفات الصور الطيفية وفصل الصبغة إلى برنامج فيجي مفتوح المصدر للتحليل. قم بتكوين معلمات قياسات القراءة في فيجي باستخدام التحليل وضبط القياسات. اختر المساحة، والكثافة المتكاملة، والقيمة الرمادية المتوسطة كمعايير الاهتمام.
باستخدام أداة اختيار المضلعات من شريط الأدوات، اختر المنطقة المعنية بحافة الجاسترولا. تسلسليا، انقر على Analyze وTools وROI Manager لحفظ مواصفات ROI xy. لإجراء القياسات بعائد استثمار محدد، انقر على التحليل والقياس.
نظم FRET حسب قيم نسبة CFP لكل عائد استثمار في ورقة عمل مع مجموعات تجريبية في الأعمدة والقيم الخام في صفوف. لتكرار بيولوجي واحد، أنشئ جدول أعمدة يحتوي على متغير تجميع واحد، حيث تعرف كل مجموعة بواسطة عمود. في نهاية عملية التمعين، يتم تثبيت الأجنة بالغمر في 4٪ من البارالديهايد المحضر في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت، اغسل الأجنة عدة مرات باستخدام PBS. باستخدام ماصحة القساوسة، وجه الأجنة جانبيا في بئر واحد من لوح يحتوي على 12 بئر يحتوي على PBS طازج. باستخدام مجهر ستيريو بهدف تكبير 2.7x مع هدف مسح 0.63x وعامل تكبير 8.6، التقط الصور في وضع الحقل الساطع لتقييم وجود شكل بيضاوي.
استيراد صورة الجنين الملتقطة إلى برنامج فيجي. لقياس طول محاور الجنين، اختر الأداة المستقيمة من شريط الأدوات واضغط على التحليل، ثم القياس. بعد إجراء القياسات المحددة، أضفها إلى قائمة مدير العائد على الاستثمار واحفظ ملف العائد على الاستثمار.
تصدير البيانات إلى ورقة عمل. احسب نسبة المحاور بقسمة طول المحور الرئيسي على طول المحور الصغير. احسب المتوسط، أو الانحراف المعياري للمتوسط، أو الخطأ المعياري لمتوسط النسخ المختلفة.
تمكن خط أنابيب FRET الحي لدينا في أسماك الزرد من الكشف المبكر الحساس لتنشيط إشارات ERK الممرضة، ودعم تفسير المتحورات، واختبار كفاءة مثبطات MEK.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا في الجسم الحي باستخدام أسماك الزرد لدراسة مستويات تفعيل ERK المرتبطة بـ RASopathy من خلال تصوير FRET الحي. يهدف هذا النهج إلى التحقق من المتغيرات المسببة للأمراض وتقييم التعديل الدوائي أثناء تطور الجنين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- RASopathies هي متلازمات وراثية مرتبطة بفرط تفعيل مسار RAS-MAPK.
- تتطلب المتغيرات الناشئة التحقق لتطوير العلاج الفعال.
- الأدلة ما قبل السريرية الحالية محدودة، مما يستلزم تحسين النماذج.
- يوفر تصوير FRET الحي طريقة جديدة لدراسة تفعيل ERK في الجسم الحي.
هدف الدراسة
- اختبار مستويات تفعيل ERK المرتبطة بـ RASopathy في أسماك الزرد.
- التحقق من المتغيرات المسببة للأمراض المحتملة المرتبطة بـ RASopathies.
- استكشاف التعديل الدوائي أثناء تطور الجنين.
الطرق المستخدمة
- إنشاء نماذج أسماك الزرد للأمراض التنموية المعقدة.
- ربط بيانات تسلسل المرضى بالجينوم الوظيفي.
- حقن بيوض أسماك الزرد المخصبة بمواد مخصصة.
- استخدام مستشعرات FRET لكشف التغيرات في إشارات Ras-MAPK.
النتائج الرئيسية
- الاندماج الناجح وحقن بيوض أسماك الزرد لتحقيق الاتساق التجريبي.
- عرض الحساسية المكانية والزمانية في كشف تفعيل ERK.
- التحقق من الفحص في الجسم الحي لتقييم التغيرات المسببة للأمراض.
- إمكانية تحسين منهجيات اختبار الأدوية ما قبل السريرية.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة إطارًا قويًا للتحقيق في RASopathies.
- يعتبر تصوير FRET الحي أداة واعدة للتحليل في الوقت الحقيقي لمسارات الإشارة.
- يمكن للبحوث المستقبلية البناء على هذه النتائج لتعزيز الاستراتيجيات العلاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid in vivo assessment of ERK activity modulation in zebrafish enables early-stage functional validation of RASopathy-associated variants, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in rare disease pipelines. The protocol's integration of live FRET imaging and immunofluorescence provides quantitative, reproducible outputs essential for preclinical evaluation of pharmacological modulators. This scalable approach enhances predictive confidence and accelerates variant triage for portfolio advancement in genetic disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of RAS-MAPK pathway variants in a live vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ERK signaling changes linked to pathogenic mutations.
- Facilitates rapid triage of candidate variants for downstream therapeutic exploration.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout of ERK activity for assay standardization.
- Delivers reproducible FRET-based measurements suitable for pharmacological screening of MEK inhibitors.
- Supports scalability and platform reuse in cost-effective zebrafish models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early functional outputs with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Enables preclinical assessment of drug repositioning candidates in a whole-organism context.
- Reduces biological risk by linking molecular activity to morphometric outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical validation by enabling real-time ERK activity measurement and pharmacological testing in zebrafish embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and variant interpretation through live ERK activity quantification.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility for MEK inhibitor evaluation.
- Analytics: Provides ratiometric FRET and morphometric data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects molecular signaling changes to phenotypic outcomes relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for diverse RASopathy and pathway-targeted studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in variant pathogenicity and drug response.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection and live imaging techniques.
- Needs access to multispectral FRET-capable confocal microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or pathway targets.
- Throughput is limited by embryo handling and imaging capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:30
Microinjection and Treatment of Zebrafish Embryos for FRET Imaging and MEK Inhibition Assays
2:13
Live Multispectral FRET Imaging of RASopathy Zebrafish Models
4:57
Postprocessing and Dye Separation for Ratiometric FRET Imaging
7:03
Quantitative Analysis of FRET Signals and Image Rendering
8:14
Assessment of Morphological Phenotypes and Image Analysis in Zebrafish Embryos
9:41
Conclusion
