كشف FISH الحساس لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات لنسخ الحمض النووي الريبي الريبوزومي الخاص بالموضع في ذبابة الفاكهة السوداء

يركز بحثنا على فهم كيفية استشعار الخلايا ومراقبة وتنظيم مواقع الحمض النووي الريبوزومي المتعددة داخل جينومها. على وجه التحديد ، نهدف إلى الكشف عن الآليات التي تميز مواقع الحمض النووي الريبوزي التي يتم نسخها بنشاط وكيف يتم تنظيم هذه المواقع بشكل فردي. لقد وجدنا مؤخرا أن كمية الحمض النووي الريفي في الخلية يمكن أن تتغير بمرور الوقت ، وأن هذا التغيير يغير مواقع الحمض النووي الريبوزي التي يتم نسخها.

نحن نفهم الآن أن الخلايا ستغير نسخ الحمض النووي الريبي الخاص بها بناء على كمية الحمض النووي الريبي لديها. يقودنا هذا الاكتشاف إلى السؤال كيف تعرف الخلايا مقدار RDA التي تمتلكها وكيف تحدد موضع rDNA الذي تفضل التعبير عنه. يركز مختبرنا الآن على فهم الآلية التي تستخدمها الخلايا للتمييز بين مواقع الحمض النووي الريبي المختلفة وإحساس نشاطها وتنظيمها.

تحت المجهر المجسم ، قم بتشريح ذبابة الفاكهة لعزل الخصيتين في PBS الخالي من RNase. للبدء ، أمسك منتصف البطن بزوج واحد من الملقط ونهاية البطن بزوج آخر لفصل برفق. باستخدام الملقط ، انقل الخصيتين المعزولين من طبق التشريح إلى أنبوب ميكروفيج سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 0.5 مل من PBS الخالي من RNase.

استنشق PBS وأضف ملليلتر واحد من محلول التثبيت. ضع العينة على شاكر الجوز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، استنشق محلول التثبيت.

ثم اغسل العينة مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما على شاكر العقدة. بعد شفط PBS ، أضف ملليلترا واحدا من الإيثانول الخالي من RNase بنسبة 70٪ واحتضان العينة عند أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر الجوز. بعد ذلك ، قم بشفط الإيثانول وأضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل إلى العينة.

احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة على شاكر الجوز لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، اترك الأنبوب يرتاح في وضع مستقيم لمدة دقيقتين. امزج المجسات والأقنعة مع المخزن المؤقت للتهجين لتحضير حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر لكل عينة كما هو موضح هنا.

ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التهجين إلى العينة بعد شفط مخزن الغسيل. ضع فيلما شفافا لإغلاق حواف الأنبوب. لف الأنبوب بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء واحتضان العينة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.

بدون شفط محلول التهجين ، أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل إلى العينة. احتضان العينة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. بمجرد شفط مخزن الغسيل ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل الطازج إلى العينة واحتضنه مرة أخرى.

في نهاية الحضانة ، قم بشفط مخزن الغسيل وأضف 50 ميكرولترا من وسائط التثبيت إلى العينة. تحت المجهر المجسم التشريح ، استخدم ماصة لنقل العينة إلى شريحة مجهرية. باستخدام الملقط ، رتب الخصيتين في خط على شريحة المجهر لتسهيل التعرف على العينة أثناء التصوير.

قم بتغطية العينة بزلة غطاء وصمة عار على حواف زلة الغطاء بمنديل مناديل لإزالة وسائط التثبيت الزائدة. أغلقي حواف الغطاء بطلاء الأظافر واتركيها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح لطلاء الأظافر بالجفاف. تم الكشف عن إشارات الرنا الريبي في النواة ، والتي تظهر كمناطق مسام DAPI داخل النواة ، لا سيما في الخلايا الجرثومية ذات النوى والنوى الكبيرة.

لوحظت إشارات باهتة وغير محددة في السيتوبلازم في عينات تفتقر إلى مواقع الحمض النووي الريبي. في معظم الخلايا ، تم اكتشاف إشارات YrRNA حصريا ، مما يشير إلى نسخ الرنا المرسال من موضع YrDNA. لوحظ التعبير المشترك ل X و YrRNA في الخلايا الجرثومية ، مع اندماج الإشارات في نواة واحدة أو الانفصال إلى نواتين.