تم تعديل مقايسة الأرقام الأكثر احتمالا لتحديد كمية السالمونيلا في منتجات الدجاج النيئة والجاهزة للطهي

يطور بحثنا تقنيات الكشف السريع عن مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء وتحديدها كميا وتوصيفها ، مع التركيز على الأساليب الحساسة التي يمكن أن تحسن سلامة الأغذية من خلال تحديد التلوث في بيئات العالم الحقيقي. تشمل التحديات الرئيسية تحقيق الكشف السريع والحساس والمصفوفات المعقدة بتكلفة منخفضة وحلول قابلة للتطوير. نعالج أيضا الصعوبات في تقليل الإيجابيات الخاطئة وتحسين التوافق مع بيئات الاختبار المتنوعة.

من أجل سلامة الأغذية ، هذا يعني الكشف الدقيق عن مسببات الأمراض بتركيزات منخفضة في مجموعة متنوعة من المصفوفات الغذائية. يعالج بروتوكولنا الفجوة بين اكتشاف انتشار السالمونيلا وتحديدها كميا لتوفير قيم حتمية لمستوى التلوث في المنتجات الغذائية. هذه العملية طفيفة الاضطراب لأنها تتضمن فحوصات تم التحقق من صحتها المستخدمة في بروتوكولات FSIS ومرنة بما يكفي لاستيعاب مسببات الأمراض الإضافية ومصفوفات الطعام.

للبدء ، ضع الدجاج المفروم الذي تم الحصول عليه من قسم اللحوم الطازجة لتجار التجزئة المحليين على منصة عمل. قسم اللحم بشكل معقم إلى عينات 25 جرام. احصل على منتجات الدجاج الجاهزة للطهي من قسم الأطعمة المجمدة لتجار التجزئة المحليين وقسمها بشكل معقم إلى عينات 25 جراما.

خط السالمونيلا المعوية المصلية Typhimurium ATCC 14028 على لوحة مثقاب تسريب القلب في الدماغ. احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 25 مل من مرق ضخ القلب في الدماغ بمستعمرة واحدة من السالمونيلا المزروعة حديثا.

تنمو الثقافة الهوائية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة. لتحضير سلسلة من التخفيف بمقدار عشرة أضعاف ، انقل 0.5 مل من المزرعة إلى 4.5 مل من ماء الببتيد المخزن أو BPW واخلطها جيدا. ثم انقل 0.5 مل من التخفيف المحضر إلى 4.5 مل من BPW لكل تخفيف لاحق.

بعد ذلك ، انقل 25 جراما من الدجاج المفروم المشع إلى أكياس معقمة معقمة. تلقيح العينة بملليلتر واحد من التركيز المطلوب لتخفيف المزرعة. باستخدام موزع الخلايا المعقم ، قم بتوزيع اللقاح برفق بالتساوي على سطح الدجاج واتركه يقف عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد احتضان عينات الدجاج المفروم المشع مع استزراع السالمونيلا لمدة ساعة واحدة ، أضف 225 مل من BPW إلى كل عينة لتحقيق نسبة العينة إلى الوسائط المطلوبة. تجانس عينات الدجاج باستخدام المعدة بسرعة طبيعية لمدة 120 ثانية. باستخدام ماصة سعة 50 مل، قم بإزالة السائل بعناية من الجانب المصفى من المعدة وقسمه إلى زجاجتين معقمتين للطرد المركزي.

الطرد المركزي للعينات عند 10،000 غرام لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة ملليلتر من BPW باستخدام ملعقة معقمة. أضف 12 مل من BPW إلى الحبيبات المعلقة واخلطها جيدا عن طريق التقليب باستخدام ملعقة معقمة.

اجمع محتويات زجاجتي الطرد المركزي في زجاجة واحدة. أضف ثلاثة ملليلتر من العينة المعلقة إلى كل بئر في العمود الأول من كتلة البئر 48 لإنشاء ثماني مكررات. لتحضير سلسلة من التخفيف بمقدار عشرة أضعاف عبر الأعمدة من واحد إلى ستة باستخدام ماصة ثماني القنوات، أضف 0.3 ملليلتر من العينة من كل بئر إلى 2.7 ملليلتر من BPW في العمود التالي لضمان الخلط الشامل.

احتضان الكتل بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، ضع سبعة ميكرولترات من المزرعة من كل تخفيف على ألواح مثقاب تسريب القلب في الدماغ في شبكة أربعة في ستة. اترك الأطباق تجف لمدة 10 دقائق قبل احتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.

بعد الحضانة ، افحص ألواح المثقاب ، وحدد مستعمرة واحدة على الأقل على أنها إيجابية ولا يوجد نمو على أنها سلبية. أدخل عدد عامل التخفيف والتخفيف في ورقة عمل. أدخل الحجم أو الوزن المناسب للعينة.

ثم حدد عدد التكرارات وأدخل عدد العينات التي ثبتت إصابتها. انقر فوق حساب النتائج لتحليل النتائج الإيجابية والسلبية المشروحة باستخدام طريقة دقة الاحتمالية القصوى البسيطة. للبدء ، قم بإعداد كتلة 48 بئر MPN لزراعة السالمونيلا الملقحة بعينات الدجاج.

امزج الثقافات في كتلة 48 بئر عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل 200 ميكرولتر من كل ثقافة إلى لوحة PCR سعة 96 بئر. أغلق اللوحة وجهاز الطرد المركزي على درجة حرارة 6 ، 600 جم لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وأضف 20 ميكرولترا من كاشف مجموعة استخراج الحمض النووي إلى الحبيبات. امزج الحبيبات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. مرة أخرى ، أغلق الطبق وقم بتسخينه على 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالتبريد إلى 20 درجة مئوية.

بعد الطرد المركزي ، استخدم ميكرولترين من المادة الطافية لتحضير خليط QPCR وفقا للبروتوكول المعمول به. باستخدام الشروط التالية ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتصدير النتائج واعتبر الآبار ذات قيم عتبة الدورة أقل من أو تساوي 30 موجبة وأكبر من 30 سالبة.

امزج الثقافات في كتلة 48 بئر عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل 20 ميكرولترا من كل عينة إلى مجموعة فحص السالمونيلا للكشف الجزيئي المتوفرة بأنبوب التحلل. سخني العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم احتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل 20 ميكرولترا من المحللة من كل أنبوب تحلل إلى أنبوب كاشف وقم بتحميل أنابيب الكاشف في الحامل. أضف الحامل مع أنابيب الكاشف إلى أداة نظام الكشف الجزيئي.

قم بتكوين إعدادات البرنامج لمقايسة نظام الكشف الجزيئي. قم بتشغيل الفحص وتصدير التقرير للتحليل. يوفر تقرير MDS Run معلومات مفصلة عن الإخراج ، وهي إيجابية أو سلبية.