زراعة وقطف وحيدة النسيلة الميكروبية الآلية وعالية الإنتاجية باستخدام نظام Omics لزراعة قطرات الميكرولتر أحادية الخلية

يستكشف هذا البحث أوميكس الاستزراع الميكروبي ، باستخدام منصة تلقائية ، لتعزيز عزل الميكروبات وزراعتها وغربلة أحادية النسيلة. الهدف هو تحسين فهم الأمعاء البشرية والميكروبيوم وتطبيقاتها. يشمل التقنيون الذين يطورون أبحاث الميكروبيوم إسقاط الموائع الدقيقة ، وعزل السلالة الأوتوماتيكي ومنصات الفحص ، وخوارزميات التعلم الآلي ، وموزعات أحادية النسيلة لعمليات الاستزراع عالية التوتر وتحليل الميكروبيوم.

يعزز نظام الخلية الوسطى بشكل كبير الرؤية الدقيقة والعزل أحادي النسيلة والتلوين ، مما يولد ما يقرب من عدد الضعف من الاستنساخ مقارنة بالطرق التقليدية ، وبالتالي تعزيز القدرة البحثية في مزيج ثقافة الأمعاء المصغرة. يلبي هذا البروتوكول الحاجة إلى منصة فحص ميكروبية منخفضة التكلفة عالية الدعم ، والتغلب على قيود الطرق التقليدية في الكفاءة والقدرة على تسجيل النقاط لأبحاث مزيج الثقافة. سيركز مختبرنا بشكل أكبر على دمج تقنيات معالجة القطرات الإضافية ، مثل تقسيم القطرات ودمجها لتوسيع نطاق التطبيقات التكنولوجية.

للبدء ، افتح باب غرفة توليد القطرات والزراعة لخلية MISS. قم بإزالة الغطاء الواقي للأنابيب الدقيقة ورقاقة الموائع الدقيقة لتوليد القطرات عموديا. باستخدام حقنة يمكن التخلص منها ، أضف 10 مل من الماء المقطر المعقم إلى المرطب داخل الغرفة وأعد تثبيت الغطاء الواقي.

افتح العبوة المعقمة لشريحة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات ، وضعها عموديا فوق غرفة الزراعة مباشرة. ثم على واجهة البرنامج ، انقر فوق التثبيت. عند ظهور نافذة التأكيد المنبثقة ، انقر فوق نعم لبدء التثبيت.

أخرج مزيل فقاعة الهواء وثبته رأسا على عقب على وضع مزيل فقاعة الهواء في الغرفة. قم بتوصيل أنبوب مخرج القطرات لمزيل فقاعة الهواء بصمام التثبيت الموجود أسفله. قم بتوجيهه عبر الكل المؤدي إلى غرفة الكشف عن القطرات وجمعها.

بعد فتح باب الغرفة ، أدخل أنبوب الكشف عموديا في مقبس الكشف. تأكد من إدخال أنبوب الكشف بالكامل. شد المسمار المثبت لأنبوب الكشف في اتجاه عقارب الساعة.

بعد التأكد من الإدخال الكامل والتأمين ، أغلق باب الغرفة. قم بتوصيل كل من أنابيب السيليكون ال 10 من رقاقة الموائع الدقيقة ، المسماة L1 إلى L10 ، بصمامات المشبك المرقمة المقابلة. بعد ذلك ، قم بتوصيل الموصل السريع من شريحة الموائع الدقيقة بالمنفذ المقابل على نظام omic ، باتباع التوصيلات المناسبة.

بمجرد اكتمال تثبيت الرقاقة ، تظهر نافذة منبثقة مع الرسالة ، يتم فتح صمام تثبيت أنابيب القطرات. انقر فوق "موافق" عند اكتمال تركيب الأنابيب الدقيقة ورقاقة توليد القطرات. بعد التأكد من توصيل جميع الأنابيب بشكل صحيح بصمامات المشبك المقابلة لها ، انقر فوق موافق.

قبل إجراء التهيئة ، انقر فوق واجهة الإعداد لتكوين المعلمات ذات الصلة ، مثل الوضع الانتقائي ، ودرجة حرارة الحضانة ، ووقت الحضانة ، وسرعة المحرض ، والطول الموجي للكشف عن OD ، والطول الموجي للإثارة والانبعاث للكشف عن التألق. انتقل إلى الواجهة الرئيسية وانقر فوق تهيئة. تظهر نافذة التأكيد المنبثقة انقر فوق نعم للسماح لنظام IC بإجراء فحص ذاتي لمكوناته ، بما في ذلك مضخة الحقن وإعدادات درجة الحرارة واختبار تفريغ نفايات السوائل ووحدة الفرز ووحدة الكشف عن القطرات.

بعد اكتمال التهيئة، انقر فوق موافق من النافذة المنبثقة. لتحضير العينة ، خذ العينة الميكروبية وقم بإجراء التخفيف التسلسلي مع الوسط المقابل لتحقيق تركيز حوالي 50 خلية لكل مليلتر للحصول على معلق عينة 40 ملليلتر. ثم قم بفك غطاء زجاجة العينة وصب تعليق البراز المخفف في الزجاجة باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي ، حتى وضع إضافة العينة.

اربط الغطاء وشبه بإحكام. ثم أدخل الموصل السريع A في الموصل السريع B لإكمال عملية تحميل العينة. بعد وضع زجاجة العينة في الموضع المحدد ، افصل الموصلات السريعة A و B عن زجاجة العينة.

قم بتوصيل الموصل السريع A لزجاجة العينة بمنفذ O3 على نظام omic. قم بتوصيل موصل C3 الموجود على شريحة الموائع الدقيقة بالموصل السريع B ، وأغلق باب الغرفة. على الواجهة الرئيسية للبرنامج ، حدد العدد المطلوب من أنابيب القطرات المراد إنشاؤها وانقر فوق إنتاج لبدء توليد قطرات خلية واحدة.

انتظر حتى تظهر النافذة المنبثقة التي تشير إلى اكتمال إنشاء القطرة ، وانقر فوق موافق. أغلق المشبك الموجود على الموصل الثلاثة وقم بإزالة زجاجة العينة. على الواجهة الرئيسية للبرنامج ، حدد نفس رقم أنابيب القطرات المستخدمة أثناء توليد القطرات.

انقر على الثقافة. تأكد من وقت الزراعة ودرجة الحرارة ، وابدأ العملية. انتظر النافذة المنبثقة التي تشير إلى اكتمال زراعة القطرات.

اضغط على زر الأشعة فوق البنفسجية في نظام omic لتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بإشعاع غرفة الكشف عن القطرات وجمعها لمدة 30 دقيقة قبل إيقاف تشغيلها. في مقعد فائق النظافة ، افتح جميع ألواح البئر البالغ عددها 96 لوحة المستخدمة لجمع القطرات ، وقم بتكديسها فوق بعضها البعض بدون أغطية ، مع ترقيمها بالتتابع من الأسفل إلى الأعلى.

تأكد من تغطية لوحة البئر العلوية بغطاء. افتح باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها ، وضع ألواح البئر في المواضع المحددة. قم بإزالة الغطاء من لوحة البئر العلوية ، ثم أغلق باب الغرفة.

قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية على نظام omic مرة أخرى لمدة 30 دقيقة لإجراء التعقيم الثانوي. بعد ذلك ، قم بإزالة مزيل فقاعة الهواء من موضع وضعه. قم بفك الغطاء وإزالة المسمار على شكل فراشة من الغطاء.

صب 200 مل من زيت إزالة فقاعات الهواء في مزيل فقاعة الهواء. قم بتأمين الغطاء بإحكام ، ثم قم بتثبيت مزيل فقاعة الهواء رأسا على عقب في موضعه المحدد. على الواجهة الرئيسية ، حدد أنبوب القطرات للفرز.

انقر فوق الفرز. أدخل عدد ألواح الآبار المراد جمعها وابدأ عملية الفرز. راقب منطقة عرض العملية للقياسات في الوقت الفعلي للكثافة الضوئية للقطرات أو قيم الفلورة.

قم بتحليل ما يقرب من 20 إلى 30 قطرة للتحقق من قيمة OD. إذا كانت معظم القطرات تحتوي على OD يبلغ حوالي 0.2، فقم بتعيين عتبة OD الدنيا على 0.5 وعتبة OD العليا على أربعة. سيقوم النظام تلقائيا بجمع القطرات ضمن هذا النطاق في 96 لوحة آبار.

انتظر حتى تظهر النافذة المنبثقة التي تشير إلى اكتمال فرز القطرات وتجميعها، ثم انقر فوق موافق. افتح باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها. ضع غطاء لوحة البئر على لوحة البئر العلوية ، وقم بإزالة الألواح معا.

انقر فوق تصدير البيانات لحفظ بيانات إشارة القطرة التي تم جمعها. انقر فوق خريطة الحرارة. حدد ملف بيانات جمع القطرات ولاحظ OD المعروض بتنسيق اللوحة الدقيقة.

تصور قيم OD هذه كخريطة حرارية حيث تتوافق شدة اللون مع توزيع OD عبر الآبار ، مما يوفر تمثيلا واضحا وبديها. تمت مقارنة تنوع أنواع ميكروبات الأمعاء البشرية التي تم الحصول عليها من نظام omic ، وطريقة الصفيحة الصلبة ، وعينة البراز الأولية على مستوى الأسرة. تم إثراء 34 عائلة ميكروبية بكل من طريقة الصفيحة الصلبة وطريقة omics المثبتة ، مع إثراء نظام omic بالإضافة إلى إثراء أربع عائلات.

كما أثرى نظام omic بشكل فعال بعض العائلات منخفضة الوفرة. على مستوى الجنس ، أثرت كلتا الطريقتين 74 جنسا ميكروبيا ، بينما أثرت طريقة خلية MISS بالإضافة إلى 13 جنسا. علاوة على ذلك ، تم إثراء جنسين موجودين في البداية بوفرة منخفضة بشكل فعال ، باستخدام نظام OMIC.

أظهرت هذه النتائج أن طريقة زراعة الخلايا MISS وفرت ظروف نمو أفضل لتلك السلالات التي كانت موجودة بنسب منخفضة أو كان أداء نمو ضعيف في المعلق الميكروبي الأصلي.