الكشف القائم على التألق لنشاط نوكلياز FEN1 وفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

قمنا بتطوير طريقة قائمة على التألق للكشف عن أنشطة نوكلياز FEN1 وفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة ، وتطوير التشخيص والبحوث العلاجية المستهدفة.

تشمل تحديات التعبير الحالية تعقيد الطرق التقليدية ومخاوف السلامة إلى جانب التكلفة العالية والمعدات المتخصصة المطلوبة للتقنيات القائمة على التألق الحالية.

عالج هذا البروتوكول أوجه القصور في الطريقة الإشعاعية التقليدية وتقنيات التألق عالية التكلفة ، ويوفر حلا للكشف أكثر أمانا وكفاءة وسهولة في الاستخدام.

سيركز مختبرنا على تحسين منصة الفحص عالية الإنتاجية لاستكشاف التطبيقات في الجسم الحي وآليات مثبطات FEN1 في علاج السرطان.

[مدرب] للبدء ، قم بتصميم خيوط قليل النوكليوتيدات DNA بناء على نشاط الانقسام المحدد ل FEN1. امزج قلة النوكليوتيدات أحادية الشريطة في الحمض النووي أحادية الشريطة في مخزن مؤقت للتلدين. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلدين والماء منزوع الأيونات لتكوين حجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولترا. ثم سخني خليط التفاعل على حرارة 100 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة في حمام معدني. انقل الأنبوب على الفور إلى 72 درجة مئوية واحتضن لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الحرارة واترك المحلول يبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة لتشكيل ركيزة الحمض النووي الكاملة مزدوجة الشريبة. لمقايسة نشاط نوكلياز FEN1 ، قم أولا بدمج ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي مع نوكلياز FEN1 في المخزن المؤقت للتفاعل. احتضن خليط التفاعل في حمام معدني عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف 20 ميكرولتر من مخزن الإنهاء 2X لإيقاف التفاعل. بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة المنتهية على هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة 12٪ معد مسبقا. قم بإخراج الجل بالكهرباء عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة. بمجرد الانتهاء ، تصور نتائج الرحلان الكهربائي تحت نظام التصوير الفلوري. باستخدام ماصة ، انقل ميكرولترين من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف ميكرولتر من نوكلياز FEN1 و 10 ميكرولتر من مخزن تفاعل 2X إلى الأنبوب وستة ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. اخلطي المحلول جيدا ، ثم احتضنيه على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، قم بسحب ماصة ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي للوصول إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولترا. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف عملي لمثبط نوكلياز FEN1 FEN1-IN-4 عن طريق إجراء تخفيف تسلسلي مزدوج من محلول مخزون مولا واحدا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ماصة ميكرولتر لكل من نوكلياز FEN1 ومثبط FEN1-IN-4 المخفف في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. بعد ذلك، قم بماصة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 2X وأربعة ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. اخلطي برفق واحتضني الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق. الآن ، أضف ميكرولتر من ركيزة DNA إلى الأنبوب لجعل الحجم النهائي يصل إلى 20 ميكرولترا. احتضن خليط التفاعل على حرارة 37 درجة مئوية في حمام معدني لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإنهاء التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإنهاء. أكد شريط البروتين الشفاف عند حوالي 45 كيلودالتون التنقية الناجحة لنوكلياز FEN1 من التعبير المستحث. ظهرت ركيزة الحمض النووي مزدوجة الشريطة المسماة بالفلوريسين عند 80 كيلودالتون ، مما يؤكد التوليف الناجح مقارنة بالركيزة أحادية الشريطة عند 59 كيلودالتون. شق نوكلياز FEN1 ركيزة الحمض النووي ذات 80 نيوكليوتيدات مزدوجة الشريطة بطريقة تعتمد على الجرعة ، مع ملاحظة انقسام كامل عند 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر. منع مركب FEN1-IN-4 بشكل كبير انقسام ركيزة الحمض النووي مزدوجة الشريطة بواسطة FEN1 ، كما يتضح من الاحتفاظ بنطاق 80 نيوكليوتيد. قلل FEN1-IN-4 من نشاط نوكلياز FEN1 بطريقة تعتمد على التركيز ، مع تركيز مثبط أقصى نصف يبلغ 14.03 ميكرومولار.