شاشة كريسبر على مستوى الجينوم للكشف عن الجينات الحساسة للإشعاع والمقاومة للإشعاع

يركز هذا البحث على شاشة كريسبر والعلاج الإشعاعي على مستوى الجينوم. نحن نقدم بروتوكولا لعرض الجينات الحساسة للإشعاع والمقاومة للإشعاع باستخدام شاشة كريسبر على مستوى الجينوم في خلية سرطان الرئة بعد التشعيع. تشمل التحديات التجريبية الحالية التأثيرات غير المستهدفة ، والتي تسببها التعقيد الهائل للجينوم والصعوبات المحتملة في استكشاف الآليات الأساسية. بالمقارنة مع طرق الفحص التقليدية ، تحقق كريسبر تعديلا وراثيا دائما وتظهر دقة فائقة ، مما يجعلها ذات قيمة خاصة في البحوث الجينومية الوظيفية واكتشاف الهدف. في المستقبل ، سيركز فريقنا على دراسة شاشة كريسبر في الجسم الحي لحل المشكلات التي تركها هذا البحث وراءها ، وسنكون ملتزمين بتحسين تقنية كريسبر.

[الراوي] للبدء ، اضبط كثافة الخلية الملتصقة إلى خمسة في 10 أس خمس خلايا لكل مليلتر. باستخدام ماصة ، قم بتوزيع ملليلترين من معلق الخلية في كل طبق مزرعة 3.5 سم للمعالجة الإشعاعية بجرعات مختلفة. ضع الأطباق في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون واحتضانها طوال الليل. قم بترقيم كل طبق استزراع 3.5 سم من واحد إلى خمسة باستخدام علامة. باستخدام مصدر إشعاع ، قم بإعطاء جرعات إشعاعية من 2 و 4 و 6 و 8 رمادي ، على التوالي ، للأطباق من اثنين إلى خمسة. اضبط كثافة الخلية المشعة إلى واحد في 10 إلى قوة خمس خلايا لكل مليلتر. قم بالبذور 10 ميكرولتر لكل بئر ، أي ما يعادل 1000 خلية لكل 100 ميكرولتر في ألواح من ستة آبار بثلاث مكررات لكل جرعة إشعاعية. ثم قم بزرع 30 ميكرولترا لكل بئر ، أي ما يعادل 3000 خلية لكل 100 ميكرولتر في ألواح 96 بئرا مع خمس مكررات لكل جرعة إشعاعية. الآن ، امزج كاشف CCK-8 مع وسيط RPMI 1640 بدون FBS بنسبة واحد إلى تسعة. أضيفي الخليط إلى الطبق المكون من 96 بئرا واحتضن الطبق في الظلام لمدة ساعة. ثم استخدم قارئ الألواح الدقيقة لقياس الكثافة البصرية عند 450 نانومتر. لبدء عملية العدوى ، قم بإعداد تدرج تركيز لوغاريتمي لفيروس العدسات من صفر إلى 800 وحدة لكل مليلتر. أضف الحجم المقابل من فيروس العدسات إلى ميكرولترين من البوليبرين لكل طبق واتركه يتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتقطير خليط البوليبرين ببطء في كل بئر. اضبط كثافة الخلايا الأبوية إلى ثلاثة في 10 إلى قوة خمس خلايا لكل مليلتر وتلقيح مليلتر واحد في كل بئر من صفيحة 12 بئرا. أضف بورومايسين في تدرج تركيز إلى الآبار. بعد 72 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر بوسط كامل يحتوي على الحد الأدنى من تركيز البيورومايسين لقتل الخلايا. احسب تعدد العدوى لكل بئر بناء على الخلايا الباقية. اضبط كثافة الخلايا الملتصقة إلى واحد في 10 إلى قوة سبع خلايا لكل مليلتر. أضف فيروس العدسات بمعدل متعدد من العدوى يساوي 0.3 إلى 30 ميكرولتر لكل طبق من البوليبرين واتركه يتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتقطير خليط العدسات والبوليبرين ببطء في طبق الثقافة الذي يبلغ طوله 15 سم. تخلط جيدا وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثاني بعد الإصابة ، قم بشفط الوسط من طبق الاستزراع واستبدله ب 15 مل من RPMI 1640 الوسط الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS. كرر نفس العلاج للخلايا الأبوية غير المصابة كعنصر تحكم سلبي واستمر في الزراعة لمدة 72 ساعة. الآن ، قم بهضم الخلايا من طبق استزراع واحد بطول 15 سم باستخدام 0.25٪ تربسين. أعد تعليق الخلايا في الوسط الكامل RPMI 1640 مع 10٪ PBS واحسب عدد الخلايا. بعد استخراج الحمض النووي الجيني لليوم صفر ، استخدم مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية NanoDrop لقياس تركيز الحمض النووي ونقائه. إعطاء جرعة مناسبة من الإشعاع للخلايا في مجموعة العلاج واترك خلايا المجموعة الضابطة دون معالجة لتتكاثر بشكل طبيعي. بعد 14 يوما من العلاج ، هضم كل من خلايا المجموعة العلاجية والمجموعة الضابطة باستخدام 0.25٪ تربسين. قم بإعادة تعليق الخلايا في الوسط الكامل RPMI 1640 مع 10٪ FBS. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS. بعد تكرار خطوة الطرد المركزي ، استخرج الحمض النووي الجيني لليوم 14 من الحبيبات وحدد تركيز الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بإعداد الاشعال المطلوبة وتخفيفها إلى 10 ميكرومولار. بعد إضافة المكونات لإعداد نظام تفاعل 20 ميكرولتر ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة عند 300 جم لمدة خمس ثوان. بالنسبة للرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ، قم بإعداد الجل ، وإزالة المشط منه ، واملأ خزان الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت كاف لتغطية الجل. أضف مخزن التحميل إلى عينة الحمض النووي واخلطه جيدا. أخيرا ، قم بتحميل الخليط في الآبار وابدأ تكوين الرحلان الكهربائي بعد 14 يوما كشف أن التعرض لاثنين من الإشعاع الرمادي قلل بشكل كبير من عدد المستعمرات الباقية مقارنة بالصفر الرمادي. أظهر اختبار CCKA انخفاضا كبيرا في قابلية الخلية للبقاء عند اثنين من الرمادي مع مزيد من الانخفاض عند جرعات الإشعاع الأعلى. أظهر العلاج بتركيزات متزايدة من بورومايسين لمدة 72 ساعة أن ميكرومولار واحد كان الحد الأدنى من التركيز المطلوب للقضاء على خلايا A549. أظهر التحقق من صحة تفاعل البوليميراز المتسلسل نطاقات مميزة في 231 زوجا أساسيا ، مما يؤكد الطول المتوقع لتسلسلات sgRNA في مكتبة كريسبر. كشف تحليل التسلسل أن ما يقرب من 60٪ من القراءات تم تعيينها بنجاح إلى الجينوم المرجعي. اتبعت أعداد قراءة sgRNA توزيع بواسون ، مطابقة التوقعات النظرية لشاشة مقياس الجينوم. أظهر تحليل PCA والخريطة الحرارية تباينا عاليا بين المجموعات وتباينا منخفضا بين المجموعات ، مما يثبت الاتساق التجريبي. حدد تحليل الأنطولوجيا الجينية استجابة تلف الحمض النووي كمسار غني أعلى من بين أفضل 15 نتيجة.