التجميع المعياري القياسي لمشغلات Polycistronic مع الاستنساخ المعياري (MoClo) باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ

طورت طرقا تسمح بتجميع الحمض النووي المعياري من أجزاء جزيئية صغيرة فردية حتى بنى بحجم الكروموسومات، وإعادة برمجة الخلايا باستخدام هذه الكروموسومات الصناعية. أحد الابتكارات المهمة في هذا المجال هو تطوير مجموعات أدوات الاستنساخ المعيارية التي تسمح بتجميع التركيبات متعددة الجينات بشكل معياري من مكتبة من الأجزاء الجزيئية الموحدة. عادة ما تصمم مجموعات أدوات الاستنساخ المعيارية لاستنساخ وحدات النسخ أحادية الكيستروني.

يوضح هذا البروتوكول طريقة قابلة للتعميم لتجميع وحدات النسخ متعددة الكسيسترونيات باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ الداخلية. تسمح هذه الاستراتيجية في استنساخ وحدة نسخ متعددة الكيسترونية باستخدام تسلسلات الترميز بمرونة إما في وحدة نسخ فردية أو في ترتيبات متعددة الكيسترون. للبدء، اختر أجزاء المستوى 0 لتجميعها في وحدة نسخ.

يجب أن تشمل هذه على الأقل RBS، وتسلسل ترميز، ومنها. اختر الموقع الذي سيتم فيه تجميع وحدة النسخ في الأوبيرون. استنادا إلى الموضع المختار، اختر البلازميد المستقبل المقابل ومحاكاة تجميع البوابة الذهبية في SnapGene.

في تفاعل البوابة الذهبية، استخدم إنزيم SAP1 لتحرير موقع ارتباط الريبوسوم، وتسلسل الترميز، والختم من البلازميدات الخاصة بهم وقطع البلازميد المستقبل. قم بتجميع موقع ربط الريبوسوم، وتسلسل الترميز، والمنهية في بلازميد المستقبل المقطوع. التالي في تفاعل البوابة الذهبية، استخدم الماصة لإضافة 50 فيمتومولة من كل إدخال مرغوب و50 فيمتومولة من بلازميد المستقبل.

ميكرولتر واحد لكل من 10x من مخزن ليغاز الحمض النووي T4، وليغاز T4، وSAP1 إلى أنبوب تفاعل. ثم أضف ماء خال من النوكلياز ليصل الحجم النهائي إلى 10 ميكرولتر. ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري.

شغل 25 دورة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، و16 درجة مئوية لأربع دقائق، و50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتدفئة تعطيل الإنزيمات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اختياريا، يتم قذف الماصة بحجم 0.5 ميكرولتر من SAP1 إلى تفاعل GG، ثم تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

يتم خلط خمسة ميكرولتر من التفاعل إلى 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية الكيميائية الفعالة. قم بتحويل الصدمة الحرارية عن طريق غمر الأنبوب في حمام ماء عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة دقيقتين. بعد ذلك، حضن الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط لمدة ساعة واحدة للمساعدة في التعافي.

تنمو صفيحة بحجم 100 ميكرولتر من التحول على صفيحة مثقاب LB تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين. حضن الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، اختر مستعمرتين أبيض باستخدام حلقة التلقيح أو رأس الماصة.

قم بتلقيح كل واحد منها في خمسة ملليتر من وسط LB يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين. احتضن الغرفة طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز بسرعة 250 دورة في الدقيقة. قم باستخراج مربعات حسب تعليمات الشركة المصنعة.

هضم ميكروغرام واحد من حمض البلازما النووي المستخرج بإضافة ميكرولتر واحد من محلول الهضم 10 أضعاف وميكرولتر واحد من BBS1. أضف ماء خال من النوكلياز ليصبح الحجم الكلي 10 ميكرولتر ثم حضن. الآن قم بتحميل البلازميد المهضوم على جل 1٪ أغاروز وشغل الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة.

ثم صور الجل وتأكد من التجميع الصحيح للبلازميد. لتجميع بناء من المستوى M، اختر وحدات النسخ من المستوى 1 التي سيتم تجميعها. محاكاة مجموعة البوابة الذهبية عن طريق تحرير وحدتي النسخ الأولى والثانية والرابط النهائي باستخدام إنزيم BBS1.

في الوقت نفسه، افتح بلازميد المستقبل، ثم جمع الأجزاء الثلاثة في بلازميد المستقبل لتشكيل وحدة النسخ متعددة الكسيسترون. أما السيطرة السلبية لتجميع البلازميدات من المستوى الأول، والتي لم تكن تحتوي على جزء منهاي، فلم تسفر عن أي مستعمرات، بينما أنتج التفاعل الكامل 292 مستعمرة بيضاء ولم تسجل أي مستعمرات حمراء. تجميع التركيب متعدد الجينات بدون الكاسيت الثاني عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أسفر عن مستعمرتين بيضاوين فقط، بينما التجميع الكامل أنتج تسع مستعمرات كبيرة و435 مستعمرة صغيرة.

عند 30 درجة مئوية، أسفر الضبط السلبي لتجميع الجينات المتعددة عن أربع مستعمرات بيضاء، بينما أسفر التفاعل الكامل عن أكثر من 1,500 مستعمرة. يعطي ملف BSA1 لبلازميد المستقبل PMA60 النطاق الفردي المتوقع عند 5,500 زوج قاعدة. كشفت عملية الهضم باستخدام BSA1 للبلازميدات من 24 مستعمرة أن 23 من أصل 24 أظهرت نمط تقييد صحيح لشريطين عند حوالي 4,300 زوج قاعدي و1,700 زوج قاعدة.

أظهر تصوير الفلورة فلورة فلورة خضراء وسماوية قوية في مستعمرات الصفائح التي تحتوي على محفز OC6، بينما أظهرت الصفائح التي لا تحتوي على محفز فلورة قليلة أو معدومة.