تحضير الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الصغيرة لتحليل الجليكان

على نطاق واسع ، يركز بحثنا على تحديد الدور الميكانيكي للسكريات ، أو الجليكان ، وكيف يمكننا الاستفادة من مسارات الارتباط بالجليكوزيل الخلوية وتحت الخلوية في الشيخوخة وكذلك اضطرابات الدماغ. حاليا ، هناك فجوة في المعرفة حول دور وتعديل الجليكان تحت الخلوية في الفيزيولوجيا المرضية المختلفة ، بما في ذلك اضطرابات الدماغ الحادة والمزمنة مثل السكتة الدماغية والزهايمر. يهدف هذا البروتوكول وبحثنا إلى تطوير المعرفة حول دور الجليكان في التفاعلات المناعية العصبية ، وكيف يمكن الاستفادة من هذه المعلومات لتصميم علاجات أفضل وفعالة للجهاز العصبي المركزي.

[الراوي] للبدء ، احصل على خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة BV-2 المشتقة من الفئران C57BL / 6. احتفظ بها في وسط DMEM منخفض الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية. قم بزراعة الخلايا في قوارير T175 حتى تصل إلى 70 إلى 80٪ من التقاء. استنشق وسائل الإعلام من القارورة. أعد تعليق بيليه الخلية في مليلتر واحد من وسط النمو. باستخدام تريبان بلو ، عد الخلايا. الطرد المركزي للخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين عند 500 جم لمدة خمس دقائق. استنشق بعناية وتخلص من المادة الطافية. أضف 800 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا A والدوامة بسرعة متوسطة لمدة خمس ثوان. ثم احتضان الأنبوب على الجليد لمدة دقيقتين بالضبط. أضف 10 ميكرولترات من كاشف عزل الميتوكوندريا B والدوامة بأقصى سرعة لمدة خمس ثوان. احتضن على الجليد لمدة خمس دقائق ، مع الدوامة بأقصى سرعة كل دقيقة. أضف الآن 800 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C واقلب الأنبوب للخلط. وأجهزة الطرد المركزي عند 700 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة ملليلترين وجهاز طرد مركزي بسعة 000 3 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الجزء العصاري الخلوي إلى أنبوب جديد. تحتوي الحبيبات على الميتوكوندريا المعزولة. أضف 500 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C إلى الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الميتوكوندريا المعزولة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل البروتين. اترك المعلق على الجليد لمدة 20 دقيقة. استنشق واستغني ثلاث مرات ، واتركيه على الثلج لمدة 20 دقيقة ، مع الدوران قبل الاستخدام. إذا لم يتم إذابته بالكامل ، أضف 50 ميكرولترا أخرى من العازلة والمسبح في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 13,000 جم لمدة 10 دقائق. بعد استعادة وتجميد المادة الطافية ، جفف باستخدام مكثف فراغ. للكشف عن الجليكانات المنبعثة ، أعد تعليق الجليكان المجفف والمرتبط في 50 ميكرولترا من الماء من الدرجة LCMS. ماصة خمسة ميكرولترات من جليكان الميتوكوندريا المعلقة على بقعة عينة على شريحة تفلون ميكروويل. تأين واكتشاف N-glycans في وضع التأين السالب باستخدام مذيب الرش الكهربائي الذي يتكون من 60٪ أسيتونيتريل وحمض خليك مللي مولار بمعدل تدفق اثنين ميكرولتر في الدقيقة وجهد 3.2 كيلو فولت. قم بإقران IR-MALDESI بمطياف كتلة HRAM تم ضبطه بقوة حل تبلغ 240,000 عرض كامل عند نصف الحد الأقصى عند نسبة الكتلة إلى الشحن 200 لتحليل ما بين 502,000 نسبة كتلة إلى شحنة في وضع التأين السالب. حدد الجليكان المرتبط ب N يدويا من خلال البحث عن الكتل أحادية النظير. تأكيد التوزيعات النظيرية باستخدام تباعد الكتلة إلى الشحنة لتحديد الأيونات المشحونة بشكل مزدوج وثلاثي مع حد أدنى لتدفق الأيونات يبلغ 1,000 أيون في الثانية. قم بتحويل أطياف الكتلة الخام لنسب الكتلة إلى الشحنة إلى كتل أحادية النظير محايدة. ثم قم بتحميل الكتل أحادية النظير إلى أداة التنبؤ ببنية قليل السكاريد عبر الإنترنت لتحديد تركيبات الجليكان المحتملة. قم بتأكيد التعليقات التوضيحية باستخدام قاعدة بيانات جليكو منسقة تجريبيا. تأكد من أن كل تعريف يقع في حدود 2.5 جزء في مليون هامش دقة قياس الكتلة ، ويحتوي على بنية الجليكان الأساسية والمرتبطة ، ويستثني البنتوز ، أو 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid ، أو السكريات الأحادية لحمض اليورونيك. لم تظهر تركيزات بروتين الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من ستة مستحضرات مستقلة أي تباين كبير ، مما يؤكد قابلية التكاثر العالية. أظهر تحليل الدم الغربي تعبير CoxIV فقط في كسور الميتوكوندريا و GAPDH فقط في الكسور السيتوبلازمية ، مما يؤكد نقاء عزلات الميتوكوندريا وغياب التلوث غير الميتوكوندريا. تم الكشف عن هياكل N-glycan مميزة من السياليلات والفسفرة والكبريتات في مستخلصات الميتوكوندريا باستخدام IR-MALDESI. أكدت القيم المربعة العالية التي تختبر جودة الملاءمة اكتشاف الجليكانات المرتبطة ب N مع واحد واثنين من مقاربات الكلور ، مما يؤكد اكتشاف تركيبات الجليكان هذه باستخدام IR-MALDESI.