تحديد أنواع المتفطرة بطريقة رقائق المصفوفة الدقيقة للحمض النووي

[راوي] يركز هذا البحث على التشخيص الجزيئي في علم الأحياء الدقيقة السريري. بالمقارنة مع طرق الكشف التقليدية ، فإن طريقة رقاقة المصفوفة الدقيقة للحمض النووي لتحديد أنواع المتفطرات حساسة للغاية ومحددة وسريعة ، والتي يمكن أن توفر مساعدة مهمة للتشخيص المبكر للمرضى السريريين. حاليا ، طرق التحديد السريع للبكتيريا الفطرية غير السلية محدودة في العديد من المختبرات الشعبية ، مما يؤثر بشكل مباشر على التشخيص السريري للمريض وعلاجه. للبدء ، اضبط درجة حرارة الحمام المائي بدرجة حرارة ثابتة على 50 درجة مئوية وقم بتسخينه مسبقا. لتحضير الرقائق ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر إلى قاع صندوق تهجين رقائق المصفوفات الدقيقة. ضع القوس بين عمودي تحديد المواقع داخل الصندوق. ضع الشريحة بعناية بحيث يكون الجانب الأمامي لأعلى على الحامل وقم بتغطيتها بزلة الغطاء بحيث يكون أربعة رؤساء متجهين لأسفل ، مما يضمن محاذاة نهاية انزلاق الغطاء مع الملصق الموجود في نهاية الشريحة. بعد ذلك ، قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي سعة 200 ميكرولتر ، أو ثمانية شرائح آبار وفقا لعدد العينات وقم بتسميتها بشكل صحيح. قم بتسخين مخزن التهجين من المجموعة على حرارة 50 درجة مئوية حتى يذوب تماما. بعد الخلط الشامل ، قم بالطرد المركزي بسرعة في جهاز طرد مركزي صغير. Aliquot تسعة ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين في كل أنبوب أو شريط محضر. أضف ستة ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابل إلى كل أنبوب ، مما يجعل الحجم النهائي 15 ميكرولتر لكل خليط تفاعل. سخني خليط تفاعل التهجين إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتشويه طبيعته باستخدام أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل أو حمام مائي. بعد علاج التمسخ ، اغمر الخليط على الفور في خليط الماء المثلج واحتضنه لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة خليط تفاعل التهجين من الحمام الجليدي واخلطه عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل مرتين. عندما لا يتبقى راسب ندف أبيض ، أضف 13.5 ميكرولتر من خليط التفاعل من خلال فتحة التحميل في زلة الغطاء. قم بتغطية صندوق التهجين وإغلاقه بسرعة وسجل رقم الرقاقة وموضع المصفوفة الدقيقة ورقم العينة. الآن ، ضع صناديق التهجين المختومة أفقيا في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة تم تسخينه مسبقا إلى 50 درجة مئوية. بعد وضع جميع الصناديق بالداخل ، ابدأ المؤقت لمدة 120 دقيقة. بعد اكتمال تفاعل التهجين ، أخرج صناديق التهجين أفقيا ، وقم بتفكيكها ، واسترداد الرقائق. ضع الرقائق على الفور على رف الشريحة داخل وعاء مملوء بمحلول غسيل الرقائق I الذي تم موازانه مع درجة حرارة الغرفة واغسلها عند 80 إلى 100 دورة في الدقيقة على شاكر بدرجة حرارة ثابتة لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الرقائق مرة أخرى باستخدام محلول غسيل الرقائق II على الخلاط الذي تم ضبطه على 80 إلى 100 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. الآن ، ضع الرقائق في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها على حرارة 100 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل الماسح الضوئي. ثم افتح البرنامج المقابل. انقر فوق زر التحكم بالليزر للسماح له بالتسخين المسبق لمدة 10 دقائق. أدخل المعلومات المتعلقة بالعينة في البرنامج. بعد انتهاء الماسحة الضوئية من التسخين المسبق، انقر فوق الزر إخراج. ضع الشريحة المجففة بثبات على قطعة القوس الصغيرة. ادفع الشريحة برفق وأفقيا في حجرة الماسحة الضوئية وانقر فوق الزر تحميل. الآن ، أدخل رقم الرقاقة في البرنامج وانقر لتحديد منطقة الكشف microarray من 1 إلى 4. انقر فوق تحديد عينة لاختيار العينات المقابلة لكل مصفوفة دقيقة. ثم انقر فوق بدء الكشف لبدء مسح الرقاقة. سيتم عرض نتائج المسح على الشاشة وحفظها تلقائيا. استخدم صفحة استعلام البيانات لإجراء استعلامات البيانات وعمليات الطباعة. بعد الانتهاء من جميع العمليات ، قم بإيقاف تشغيل الليزر ، واخرج من البرنامج ، وأخيرا ، قم بإيقاف تشغيل الماسح الضوئي. يتم تأكيد صحة النتائج التجريبية من خلال مراقبة الجودة مع التحكم الإيجابي الذي أسفر عن نتيجة كشف عن مجمع المتفطرة السلية والعنصر السلبي الذي لا ينتج عنه أي متفطر. يبدأ تفسير عينات الاختبار بالحالات التي تكون فيها جميع المجسات ، بما في ذلك تلك ذات أعلى قيمة إشارة ، سلبية ، مما يؤدي إلى تقرير عدم وجود متفطرة. في العينات التي يظهر فيها مسبار مجمع المتفطرة السلية فقط إشارة قوية ، يتم تحديد النتيجة على أنها إيجابية لمجموعة الأنواع تلك. إذا كان المسبار المقابل ل المتفطرة الطيور هو الوحيد الذي يحتوي على إشارة قوية ، تحديد العينة على أنها إيجابية للمتفطرة الأخي. إذا كان مسبار المراقبة الداخلية فقط إيجابيا وجميع الأنواع الأخرى سلبية ، يتم الإبلاغ عن النتيجة على أنها غير محددة ، مما يشير إلى وجود أنواع من المتفطرات غير مشمولة بمجموعة الكشف.