القياس الخلوي للتدفق الفوسفوري داخل الخلايا لزراعة الأعضاء الغريبة المشتقة من المريض

يهدف بحثنا إلى فهم كيف يطور ابيضاض الدم النخاعي الحاد مقاومة للعلاجات المعتمدة. بناء على الفرضية القائلة بأن التمثيل الغذائي يلعب دورا رئيسيا. الهدف النهائي هو تحديد الاستراتيجية التي يمكنها التغلب على هذه المقاومة بشكل فعال. يعد قياس التدفق الخلوي ، المستخدم على نطاق واسع في أبحاث سرطان الدم ، مثاليا لتحليل الخلايا المعلقة مثل خلايا سرطان الدم. قدرتها على التكيف تجعلها أداة قوية للآلية الجزيئية للبيانات. يتمثل التحدي التجريبي الرئيسي في أبحاث ابيضاض الدم النقوي الحاد في تطوير بروتوكول مثالي في الجسم الحي للإحياء الجزيئي ، وهو خلية للنمذجة بدقة ، وفهم الآلية الكامنة وراء مقاومة العلاجات.

[راوي] للبدء ، ثني ركبة الفأر واستخدم اليد غير المهيمنة لشل حركة الساق من أجل كشف السطح المفصلي لعظم الفخذ حيث يوجد جانب الثقب. ضع الإبهام على الساق ، والإصبع السبابة على عظم الفخذ ، والإصبع الأوسط على الجانب الخارجي من العظام لتثبيتها. مع الحفاظ على الشلل ، قم بتطهير منطقة الركبة بكحول الأيزوبروبيل لتحريك الشعر المتبقي جانبا وتعزيز تصور بنية العظام. باستخدام أول حقنة جافة قياس 25 ، ضع الإبرة في منتصف مفصل عظم الفخذ وقم بتدويرها برفق لعمل ثقب في السطح المفصلي الفخذي دون استخدام القوة. بمجرد دخول الإبرة إلى النخاع ، اسحب المحقنة تدريجيا أثناء تدويرها. أدخل المحقنة الثانية المتدفق في الفتحة التي أحدثتها الإبرة الأولى. ضع المكنسة الكهربائية على المحقنة الثانية التي يتم إدخالها في عظم الفخذ أثناء تدويرها برفق وسحبها تدريجيا. انقل نخاع العظم المستخرج عن طريق شطف محتويات المحقنة في أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS. احتفظ بالعينة على الثلج. ضع ضغطا برفق على موقع الثقب باستخدام مسحة الأيزوبروبانول لمدة 30 ثانية لوقف أي نزيف. قم بطرد مركزي الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام نظام شفط الفراغ ، قم بشفط المادة الطافية برفق وتخلص منها. أضف 200 ميكرولتر لكل عينة من محلول تلطيخ الخلايا الفلورية. مخفف من واحد إلى 100 في برنامج تلفزيوني لتسمية الخلايا الميتة. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة. ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، محمية من الضوء. بعد 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية والتخلص منها باستخدام نظام التفريغ ، أضف 100 ميكرولتر لكل عينة من الجسم المضاد للأشعة فوق البنفسجية اللامع HCD 45 المخفف إلى واحد إلى 100 في PBS يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني لتسمية الخلايا المكونة للدم البشرية. احتضن الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة ، مع التأكد من حمايتها من الضوء. قم بطرد مركزي الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. شفط المادة الطافية والتخلص منها باستخدام نظام تفريغ. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 1.6٪ فورمالديهايد في محلول PBS. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، محمي من الضوء. بعد 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. شفط المادة الطافية والتخلص منها باستخدام نظام تفريغ. أضف الآن مليلترا واحدا من الميثانول بنسبة 100٪ ، مبردا مسبقا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر مباشرة إلى الاثنين. احتضان العينات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء. قم بطرد مركزي الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام نظام تفريغ ، قم بشفط الطافق وتجاهله. أضف 50 ميكرولتر من محلول مختلط الأجسام المضادة أو محلول مختلط للتحكم في النمط المتماثل لكل عينة. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة ، واحتضن جميع العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، مع التأكد من حمايتها من الضوء. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الخلايا ب 1000 ميكرولتر من PBS عن طريق إعادة تعليقها برفق باستخدام ماصة. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإجراء غسيل ثان باستخدام 1000 ميكرولتر من PBS وأعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة قبل طرد الخلايا مرة أخرى عند أربع درجات مئوية. بعد شفط المادة الطافية ، أعد تعليق العينات النهائية في 200 ميكرولتر من PBS. يوضح هذا الشكل سير العمل واستراتيجية البوابات وتطبيع إشارات البروتين الفوسفوي داخل الخلايا في خلايا نخاع العظام من الفئران المشتقة من مرض سرطان الدم النخاعي الحاد المشتقة من الفئران الغريبة التي عولجت بالعلاج القائم على venetoclax لمدة 15 يوما. نجحت استراتيجية البوابات في تحديد ابيضاض الدم النخاعي الحاد البشري القابل للحياة أو خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد القابل للحياة بناء على ملامح التشتت الأمامية والجانبية وإيجابية CD45 ، مما يتيح تحليلا متسقا عبر جميع مجموعات العلاج. أدى علاج Venetoclax 5-azacitidine و CDZ uridine إلى زيادة فسفرة STAT5 و RPS6 في خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد مما يشير إلى تنشيط مسارات البقاء المرتبطة بالمقاومة. ومن المثير للاهتمام ، أنه عندما عولجت الفئران ب Gilteritinib ، لم يقلل العلاج بشكل كبير من فسفرة بروتينات مسار FLT3 مما يشير إلى أن الإشارات استمرت على الرغم من العلاج الموجه. أظهر STAT5 الفسفري و RPS6 الفسفرة أقوى زيادة في الارتباط في مستويات التعبير بعد العلاج القائم على venetoclax مما يشير إلى التنشيط المشترك لهذه المسارات.