في المختبر مزرعة الخلايا التائية البطية الخاصة ب H5N1 والكشف عن الاستجابات المناعية باستخدام طريقة تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا

نحن نهدف إلى إنشاء بروتوكول في المختبر لزراعة الخلايا التائية البطية الخاصة ب H5N1 وتحديد إفراز IFN-γ باستخدام تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا. تسلط الدراسات الحديثة الضوء على أهمية مناعة الخلايا التائية للطيور في السيطرة على الالتهابات الفيروسية ، لكن طرق الاستزراع الموحدة لا تزال غير متوفرة للبط. نجحنا في زراعة خلايا البط التائية الخاصة ب H5N1 وطورنا بروتوكول ICS جديد قائم على التدفق المقطع للكشف عن تعبير IFN-γ البط. سوف نستكشف استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في أنواع الدواجن الأخرى ونطور أدوات مناعية للطيور لتقييم اللقاحات والبحوث المضادة للفيروسات.

[الراوي] للبدء ، قم بعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، أو PBMCs ، من البط المصاب بفيروس H5N1 قبل 28 يوما ، واضبط تركيز الخلايا المعزولة إلى 3 أضعاف 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر. الآن ، قم بتوزيع 1 مليلتر من الوسط على كل بئر من صفيحة 48 بئر. بعد ذلك ، أضف فيروس أنفلونزا الطيور H5N1 إلى PBMCs بعدوى متعددة قدرها 5 لإصابة الخلايا ، واحتضان الزراعة المشتركة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. كل 15 دقيقة ، رج الطبق برفق باليد لضمان التوزيع المتساوي. بعد ساعة واحدة من الإصابة ، اغسل PBMCs مرتين باستخدام PBS لإزالة جزيئات الفيروس غير المرتبطة. أعد تعليق PBMCs المغسولة في 1 مليلتر من وسط زراعة الخلايا التائية واحتضان المعلق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 440 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا العارضة للمستضد المحببات ، أو APCs ، في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا التائية ، وأضف APCs المعلقة إلى الخلايا المستجيبة بنسبة 1 إلى 5. الآن ، احتضن الاستزراع المشترك في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 14 يوما. كل يومين ، قم بإزالة نصف المادة الطافية باستخدام ماصة. تخلص من الخلايا التي تحتوي على الوسط المستخدم وأضف حجما متساويا من وسط الخلايا التائية الطازجة. في اليوم السابع ، راقب الخلايا تحت مجهر بصري عند 100x. تعامل مع مجموعة منفصلة من APCs الذاكرة باستخدام PBS واستخدمها كمجموعة تحكم غير محفزة. في اليوم السابع ، قم بإزالة مزارع الخلايا التائية الخاصة ب H5N1 من الحاضنة وحصاد جميع الخلايا من كل بئر في أنبوب. الآن ، أضف ناقلات الجنود المدرعة المحتضنة و brefeldin A عند تخفيف من 1 إلى 1000 إلى الخلايا المستجيبة واحتضانها لمدة ست ساعات في حاضنة 39 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وقم بتدويرها عند 440 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على الجسم المضاد CD8 المضاد للفأر إلى الخلايا ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من PBS. الطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف الجسم المضاد IgG2b للماعز المترافق ب FITC ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. ثم قم بتدوير الخلايا مرة أخرى عند 400 × جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت واحتضان الخليط لمدة 20 إلى 25 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مليلتر من 1x المخزن المؤقت للنفاذية كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية. احتضان الخلايا بجسم مضاد IFN-γ مضاد للفأر مخفف من 1 إلى 10 لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. بعد غسل الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد IgG3 للماعز المترافق ب PE المخفف من 1 إلى 250 ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. أخيرا ، قم بتحليل العينات المعالجة باستخدام برنامج FlowJo. بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا العارضة للمستضد ، أظهرت الخلايا التائية الخاصة بالفيروس نموا عنقوديا ، مما يدل على الانتشار الناجح. كشفت ملصقات إستر الكربوكسي فلوريسين السكسينيمديل عن قمم متعددة لانقسام الخلايا في العينات المحفزة ، مما يؤكد الانتشار الواسع للخلايا التائية لذاكرة البط. كانت نسبة الخلايا التائية CD4 + و CD8 + أعلى بشكل ملحوظ في الثقافات المحفزة ب H5N1 مقارنة بالضوابط غير المحفزة بعد 14 يوما. أظهرت الخلايا التائية المتكاثرة في اليوم السابع من الثقافة تعبيرا مرتفعا عن الجينات المرتبطة بالسمية للخلايا ، مثل الجرانزيم أ والإنترفيرون جاما ، مما يشير إلى وجود نمط ظاهري سام للخلايا. كشف قياس التدفق الخلوي عن زيادة كبيرة في نسبة الخلايا الإيجابية للإنترفيرون جاما داخل كل من خلايا CD8 العالية و CD8 منخفضة الخلايا التائية بعد تحفيز المستضد.