Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

Jiani Ge; Yunfan Sun; Jingsheng Hua; Yuanhong Huang; Yi Wang; Dandan Tang; Taoyun Wang; Jinli Li; Yanfeng Deng; Song-Bai Liu

doi:10.3791/68469

مقايسة المذنب لقياس تلف الحمض النووي في خلايا 32D التي تعبر عن طفرات FLT3 بعد التعرض لمثبطات FLT3...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

مقايسة المذنب لقياس تلف الحمض النووي في خلايا 32D التي تعبر عن طفرات FLT3 بعد التعرض لمثبطات FLT3 من النوع الأول والثاني

Full Text

849 Views

04:36 min

October 17, 2025

DOI: 10.3791/68469-v

Jiani Ge*^1,2, Yunfan Sun*³, Jingsheng Hua*⁴, Yuanhong Huang⁵, Yi Wang², Dandan Tang¹, Taoyun Wang¹, Jinli Li⁶, Yanfeng Deng⁷, Song-Bai Liu^1,2

¹Department of Chemistry and Life Sciences,Suzhou University of Science and Technology, ²Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology,Suzhou Vocational Health College, ³Department of Hematology,The Second Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine,Taizhou University, ⁵National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology,The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁶Department of Radiation Oncology,The Affiliated Hospital of Soochow University, ⁷Department of Medical Ultrasound,Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study employs the comet assay to evaluate the genotoxic effects of type I and type II FLT3 inhibitors on FLT3 mutant 32D cells, highlighting significant DNA damage caused by AC220 compared to Gilteritinib. The findings contribute critical insights toward optimizing therapeutic strategies in acute myeloid leukemia (AML).

Key Study Components

Research Area

Genotoxicity evaluation in cancer
Therapeutic resistance in AML
Combination therapy strategies

Background

The importance of targeting FLT3 mutations in AML
Mechanisms of resistance against existing therapies
Role of DNA damage in cancer treatment efficacy

Methods Used

Comet assay for quantifying DNA damage
FLT3 mutant 32D cells as the biological model
Usage of type I and type II FLT3 inhibitors

Main Results

AC220 induces more significant DNA damage compared to Gilteritinib
Quantitative data shows increased tail DNA percentage post-treatment
Statistically significant damage noted across all time points measured

Conclusions

This research demonstrates differential genotoxic effects of FLT3 inhibitors on mutant cells
Findings support the development of targeted combination therapies to combat AML therapeutic resistance

Frequently Asked Questions

What is the comet assay used for in this study?

The comet assay is utilized to quantify DNA damage induced by FLT3 inhibitors in mutant cells.

What are FLT3 inhibitors?

FLT3 inhibitors are targeted therapies designed to treat FLT3-mutant acute myeloid leukemia (AML).

Why is DNA damage important in cancer therapies?

DNA damage can determine the efficacy of cancer treatments by affecting the cell's ability to replicate and repair.

What were the main findings regarding AC220?

AC220 was found to cause more severe DNA damage in FLT3 mutant cells compared to Gilteritinib.

How does this study inform future cancer treatments?

The findings suggest potential for developing combination therapies that exploit DNA damage vulnerabilities in resistant cancer cells.

What model system was used in this research?

The study used FLT3 mutant 32D cells as the model system for testing genotoxic effects.

What is the significance of the observed DNA damage?

The severity of DNA damage can indicate therapeutic effectiveness and inform treatment decisions in AML.

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لقياس الفرق في تلف الحمض النووي الناجم عن مثبطات النوع الأول والنوع الثاني في الخلايا الطافرة FLT3 من خلال تطبيق مقايسة المذنب.

نحن نستخدم مقايسة المذنب لتقييم السمية الجينية لمثبطات FLT3 من النوع الأول والثاني بشكل منهجي على الخلايا الطافرة 32D FLT3 ، مما يوفر بيانات مهمة للتحسين السريري في ابيضاض الدم النقوي الحاد. أثناء الإجراءات ، ستؤدي أداة الجراحة المجهرية للمعالجة غير السليمة إلى تغيير الشريحة ، مما يؤدي إلى فقدان العينة. تشير الأبحاث إلى أن AC220 باعتباره المثبط من النوع الثاني يلحق أضرارا أكثر خطورة في الحمض النووي بالخلايا الطافرة FLT3 ، مما يوفر رؤى حاسمة لتطوير العلاجات المركبة من خلال استغلال ضعف تلف الحمض النووي للتغلب على المقاومة العلاجية.

التحقيق في آلية عمل مثبطات FLT3 في علاج ابيضاض الدم النقوي الحاد ، وتطوير استراتيجيات العلاج المركب ثنائي الدواء أو متعدد الأدوية بناء على مثبطات FLT3. للبدء ، قم بإعداد خليط من 10 إلى واحد من الاغاروز منخفض درجة الانصهار ومعلق الخلية في أنابيب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة ، واخلطها برفق. قم بتوزيع 55 ميكرولتر من خليط خلايا الاغاروز على شرائح المذنب باستخدام ماصة مثبتة بزاوية 45 درجة.

ثم ضع الشرائح المغطاة بالخليط على حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في بيئة مظلمة. اغمر الشرائح الصلبة في محلول تحلل مبرد مسبقا واحتضن لمدة ساعة واحدة على الأقل عند أربع درجات مئوية ، مما يحمي الشرائح من الضوء. بعد التحلل ، قم بإزالة الشرائح من محلول التحلل.

باستخدام مسدس ماصة ، امتص بعناية أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي من حول المجداف. بعد ذلك ، ضع الشرائح في مخزن مؤقت للرحلان الكهربائي القلوي واتركها تتوازن مسبقا لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في الظلام. الآن ، ضع الشرائح في غرفة الرحلان الكهربائي.

لغمر الشرائح بالكامل ، أضف ما يكفي من محلول الرحلان الكهربائي القلوي المبرد مسبقا. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي بجهد 24 فولت بتيار ثابت لمدة 30 دقيقة باستخدام مخزن مؤقت متوازن مسبقا لتقليل تلف الحمض النووي. بعد الرحلان الكهربائي ، استخدم مسدس ماصة لشفط المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي القلوي من حول الشريحة.

اغمر الشرائح في ماء مقطر مزدوج لمدة خمس دقائق ، ثم اغمر الشرائح في 70٪ إيثانول لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى تجف. بعد ذلك ، ضع 100 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي YeaRed على كل بئر من الشريحة.

احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة عند 28 درجة مئوية في بيئة محمية من الضوء. اشطف الشرائح برفق بالماء لإزالة البقع الزائدة وتجفيفها في حاضنة 37 درجة مئوية. تم استخدام مقايسة المذنب بشكل منهجي لتحديد ملامح تلف الحمض النووي التفاضلية الناجمة عن Gilteritinib و AC220 في خطوط الخلايا الطافرة FLT3.

أكد التحليل الكمي لنسبة الحمض النووي للذيل أن كلا المركبين يزيدان بشكل كبير من تلف الحمض النووي بعد ساعتين وأربع وست ساعات ، حيث ينتج AC220 مستويات ضرر أعلى من Gilteritinib في كل نقطة زمنية. عكست جميع قياسات الذيل اللحظية اتجاه الحمض النووي للذيل مع زيادات ذات دلالة إحصائية لكلا العلاجين من ساعتين إلى ست ساعات وقيم OTM أعلى لوحظت في مجموعة AC220 طوال الوقت.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos