مسبار التهجين المنفصل باستخدام أبتامر إضاءة فلورسنت للحمض النووي كمراسل إشارة لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل
July 8th, 2025
يحدد هذا البروتوكول تصميم مجسات التهجين المنقسمة باستخدام أبتامر الإضاءة الفلورية DAP-10-42 كمراسل إشارة وتطبيقها للكشف عن الحمض النووي والتمايز بين الأهداف ذات بدائل أحادية النيوكليوتيدات.
نحن نعمل على تطوير أنواع جديدة من مجسات تهجين الفلورسنت لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل. في الآونة الأخيرة ، توسعت أدوات تحليل التهجين بالفحوصات التي تستفيد من أنظمة CRISPR-Cas. حاليا ، يتم استخدام مجسات التهجين الحديثة ، مثل TaqMan ، ومجسات المنارة الجزيئية ، بشكل أكبر لتحليل أهداف الحمض النووي.
لا يزال الكشف الدقيق عن بدائل النيوكليوتيدات المفردة وأهداف الحمض النووي يمثل تحديا عمليا. يضمن بروتوكولنا المستوى المطلوب من نشاط الخلية مع توفير إشارة فلورسنت خالية من الملصقات مقروءة. للبدء ، قم بتصميم تسلسل اثنين من خيوط قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي غير المعدلة التي تشكل SLAS.
استخدم جزءا يحتوي على النيوكليوتيدات من 6 إلى 39 من DAP-10-42. قم بتحويل الجذع 1 الذي يتكون من النيوكليوتيدات من 1 إلى 8 ومن 36 إلى 42 إلى جذع 1 أولي عن طريق إزالة الثايمين المنتفخ في الموضع 5 ، وتقصير الجذع إلى أربعة أزواج أساسية وإضافة زوج من قاعدة السيتوزين والجوانين الطرفية. قم بتضمين النيوكليوتيدات من 9 إلى 29 في خيط SLAS واحد والنيوكليوتيدات من 30 إلى 35 في الآخر.
قم بتمديد التسلسل الطرفي الثلاثة الأولي للجزء بالنيوكليوتيدات من 9 إلى 29 بإضافة deoxy GGTCAT. ثم قم بتمديد التسلسل الطرفي الخمسة الأولي للجزء من 30 إلى 35 باستخدام deoxy TGACC لتشكيل جذع زوج من ستة قواعد 2. الآن قم بتمديد الجذع 1 رئيس على كلا الخيوط باستخدام روابط deoxy TT ، وتسلسلات الحمض النووي المكملة لهدف الحمض النووي.
ينتج عن هذا تسلسل خيوط SLAS-U و SLAS-S التي تشكل المسبار. اجعل SLAS-S مجانيا لمنطقة من 7 إلى 10 نيوكليوتيدات. يتضمن ذلك موقع استبدال النيوكليوتيدات الفردية.
ثم تأكد من أن ذراع الربط المستهدف ل SLAS-U مكمل لجزء من 15 إلى 25 نيوكليوتيد مجاور لمنطقة SLAS-S. تقييم درجات حرارة انصهار الطباعة المزدوجة، المزدوجة الملزمة المستهدفة، باستخدام خادم الويب UNAFold. انقر فوق علامة التبويب INAMelt.
انتقل إلى التطبيقات وحدد تهجين ذوبان الحالتين. أدخل التتابعات المتفاعلة بخمسة أولي إلى ثلاثة ترتيب أولي في المربعين الأيمن والأيسر. ثم اضبط درجة حرارة الفحص على 22 درجة مئوية وأدخل تركيزات الكاتيون أحادية التكافؤ وثنائية التكافؤ إلى أيونات 20 ملليمولار و 25 ملليمولار ، على التوالي.
اضبط تركيزات التسلسلات المتفاعلة في المربع المقابل. اضغط على إرسال ومراجعة قيم تغير طاقة Gibbs ، والمحتوى الحراري Y ، والانتروبيا ، ودرجة حرارة الذوبان للازدواج المقابل. تأكد من أن درجات حرارة الانصهار للأهداف المتطابقة تماما وأذرع ربط الهدف ل SLAS-S و SLAS-U أعلى من درجة حرارة الفحص ، 22 درجة مئوية.
تأكد من أن الازدواج بين SLAS-S والهدف غير المتطابق ينتج عنه درجات حرارة ذوبان أقل من درجة حرارة الفحص للحفاظ على الخصوصية. إذا لزم الأمر ، اضبط أطوال أذرع ربط الهدف لتلبية هذه الشروط. احصل على خيوط قليل النوكليوتيدات SLAS-U و SLAS-S النهائية من مورد DNA تجاري أو قم بتصنيعها داخليا باستخدام مركب الحمض النووي الآلي.
قم بإعداد محاليل مخزون Auramine O و SLAs-S و SLAS-U ومخزن الفحص العازل. قم بإعداد المزيج الرئيسي الذي يحتوي على جميع مكونات الفحص باستثناء الهدف. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى المجلد الخمسة الأخير في المجلد السادس من المزيج الرئيسي.
ثم دوامة وتدور المزيج الرئيسي. قم بتوزيع 50 ميكرولتر في كل أنبوب عينة. بعد ذلك ، قم بتسمية عينة واحدة على أنها فارغة بدون هدف وواحدة كعنصر تحكم إيجابي.
أضف 10 ميكرولتر من العينة المحتوية على الهدف إلى أنبوب يحتوي على المزيج الرئيسي لعمل عينة 60 ميكرولترا. للفراغ ، أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. ثم ماصة 10 ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات التركيبي يحتوي على التسلسل المستهدف في أنبوب التحكم الموجب.
امزج جميع العينات في جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق. ثم احتضن الأنابيب على حرارة 22 درجة مئوية لمدة 10 إلى 60 دقيقة. قياس التألق عند 540 نانومتر عند الإثارة عند 475 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري.
تم تصميم SLAS لاستهداف جزء معين من الجين NANOGP8. كان الهدف M مكملا تماما لخيط SLAS-S ، بينما كان لدى الهدف MM موضع نيوكليوتيدات السيتوزين 1 ، 423 ، مما أدى إلى عدم تطابق مع SLAS-S. عند إضافة الهدف M المكمل بالكامل ، زاد التألق بشكل مطرد واستقر بعد 45 إلى 50 دقيقة.
ومع ذلك ، كان من الممكن اكتشاف إشارة واضحة في غضون 10 دقائق مع نسبة إشارة إلى فارغة تبلغ 10 SLAS أظهرت إشارة مضان عالية للأهداف المتطابقة تماما ، ولكن ليس للأهداف أو الفراغات غير المتطابقة. زاد ناتج التألق خطيا مع تركيز مستهدف يصل إلى 500 نانومولار ، مما يتيح القياس الكمي وتحديد حدود الكشف. أظهرت العينات المضخمة PCR مستويات متفاوتة من الإشارة مع العينة 2 فقط التي تتجاوز قيمة عتبة التألق 2.
بناء على منحنى المعايرة ، قدر تركيز NANOGP8 أمبليكون في العينة 2 ب 124 + أو 13 نانومولار. كان الكشف عن التألق لإشارة SLAS متسقا عبر كل من مقياس الطيف الضوئي على الطاولة ومقياس الفلور المحمول. كما لوحظت نسبة إشارة إلى فارغة أعلى من 20 بصريا باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تطوير sondes التهجين الفلوري لتحليل خاص للحمض النووي، مع التركيز على استخدام DAP-10-42 كمبلغ عن الإشارة. يتناول التحديات في اكتشاف استبدالات النيوكليوتيدات المفردة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- سوندات التهجين الفلوري
- كشف الحمض النووي
- استبدالات النيوكليوتيدات المفردة
الخلفية
- تشمل أدوات تحليل التهجين الحالية sondes TaqMan وsondات المنارة الجزيئية.
- يظل الكشف الدقيق عن أهداف الحمض النووي تحديًا.
- وسعت أنظمة CRISPR-Cas من قدرات تحليل التهجين.
- تعد قراءات الإشارة الفلوري غير الملصقة ضرورية للتحليل الفعال.
هدف الدراسة
- تصميم sondات التهجين المنقسمة لتحسين كشف الحمض النووي.
- التمييز بين الأهداف ذات الاستبدالات المفردة للنيوكليوتيدات.
- ضمان نشاط الخلية أثناء توفير إشارات فلورية دقيقة.
الطرق المستخدمة
- تصميم سلسلتين غير معدّلتين من أوليجو نيوكليوتيدات الحمض النووي.
- استخدام sond التهجين الفلوري DAP-10-42.
- تطبيق sondات التهجين المنقسمة في تحليل الحمض النووي.
- تقييم كفاءة قراءة الإشارة.
النتائج الرئيسية
- تصميم ناجح ل sondات التهجين المنقسمة.
- تمييز فعال لأهداف الحمض النووي.
- قراءة إشارة فلورية غير ملصقة موضحة.
- تحسين الدقة في اكتشاف استبدالات النيوكليوتيدات المفردة.
الاستنتاجات
- تعزز sondات المطورة قدرات كشف الحمض النووي.
- توفر طريقة موثوقة لتحليل الاختلافات المفردة للنيوكليوتيدات.
- يمكن لهذا النهج أن يتقدم في مجال تحليل الحمض النووي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Sequence-specific nucleic acid analysis using split hybridization probes with DNA fluorescent light-up aptamers (FLAPs) addresses the persistent challenge of detecting single-nucleotide substitutions with high specificity and quantitative confidence. This approach enables label-free, cost-effective, and scalable fluorescence-based readouts, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery and screening workflows. The method's selectivity and quantitative outputs are directly relevant for portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting single-nucleotide substitutions with high selectivity.
- Supports functional target validation through quantitative, sequence-specific fluorescence outputs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing perfectly matched from mismatched nucleic acid targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, label-free assay systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence measurements for assay development.
- Enables rapid, scalable, and portable screening readiness using conventional or handheld fluorescence detection platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports translational biomarker alignment by enabling detection of clinically relevant single-nucleotide variants.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation with quantitative, sequence-specific outputs.
- Reduces biological risk by enabling precise discrimination of target variants in complex samples.
Pipeline & Workflow Integration
This split hybridization probe platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, assay development, and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling sequence-specific nucleic acid detection.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for reliable compound or target evaluation.
- Analytics: Delivers measurable readouts and statistical discrimination between matched and mismatched targets.
- Translational Research: Aligns with biomarker-driven studies by enabling detection of single-nucleotide variants in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free detection capability adaptable across diverse nucleic acid targets and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling single-nucleotide resolution.
- Operational Value: Standardizes and simplifies assay workflows with label-free, scalable detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid probe design and melting temperature analysis.
- Needs access to fluorescence spectrophotometers or portable fluorometers for quantitative readout.
- Demands cross-team standardization of probe synthesis and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various nucleic acid targets by customizing complementary sequences and probe arms.
- Specificity depends on careful optimization of probe-target duplex stability and assay temperature.
