إطار تصوير متعدد الوسائط لتعزيز التنميط الظاهري لخلايا سرطان الثدي الحية الخالية من الملصقات

الآن بروتوكولنا ، نقدم تصويرا متعدد الوسائط باستخدام التحليل الطيفي المجهري رامان متحد البؤر والفحص المجهري للطور المقطعي من أجل التنميط الظاهري الكيميائي المورفوكيميائي السريع وغير المتحيز لخلايا سرطان الثدي البشرية في بيئتها الفسيولوجية الأصلية. يتيح الجمع بين التحليل الطيفي المجهري رامان والفحص المجهري لطور التصوير المقطعي التصوير الخالي من الملصقات في ظل الظروف الفسيولوجية ، مما يوفر معلومات كيميائية حيوية ومورفولوجية حول الخلايا ويعالج قيود طرق الاضطراب التقليدية ، مثل وضع العلامات الفلورية أو التثبيت الكيميائي. تظهر نتائجنا إمكانات عالية لتنفيذ نهج متعدد الوسائط في توفير التنميط الظاهري الكيميائي الشكلي لخلايا سرطان الثدي. علاوة على ذلك ، فإن تعدد استخداماته وقابليته للتكاثر وعدم التدخل الجراحي جعل أداة واعدة لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية ، من دراسات بيولوجيا الخلية الأساسية إلى التشخيص.

نحن نهدف إلى إنشاء أطلس من المؤشرات الحيوية البصرية لمراقبة الجودة الجنينية غير الغازية ، والكشف عن الشيخوخة الخلوية ، وفحص الأدوية في النماذج العضوية لتعزيز الطب التجديدي وأبحاث الأمراض.

[مدرب] للبدء ، ضع عينة خلايا سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 في الحاضنة على خشبة المسرح. أضف الماء لغرض الغمر في الماء. قم بتشغيل وحدة التغذية الأوتوماتيكية بالغمر في الماء لتزويد العدسة الشيئية بالمياه. تحقق من مستويات المياه بانتظام لتجنب التبخر وضمان ظروف تصوير متسقة طوال القياسات. الآن ، قم بتشغيل ليزر المضخة واضبط إخراجه للوصول إلى طاقة ليزر تبلغ 75 مللي واط على مستوى العينة. افتح برنامج التحكم في المجهر Micro-Manager. في إعدادات التكوين، حدد BF وانقر فوق مباشر على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج. اختر الخلية المفردة المطلوبة، ثم انقر فوق إيقاف لإنهاء تصور المجال الساطع. افتح برنامج التحكم في كاميرا CCD. في إعداد التجربة، اضبط وقت التعريض الضوئي على 1.5 ثانية. انقر فوق تشغيل على شريط أدوات التجربة وقم بتشغيل شعاع الليزر. بعد ذلك ، اضبط موضع Z لزيادة عدد الإشارات في منطقة بصمة الإصبع من 600 إلى 1,800 سم معكوس ، ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر. انقر فوق إيقاف على شريط أدوات التجربة واخرج من البرنامج. ابدأ عملية الحصول على البيانات باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، والذي يدير تلقائيا قنوات Raman في قياسات متعددة الأبعاد ويحفظ البيانات. اضبط مجال الرؤية على 50 × 50 ميكرومتر مربع بدقة 40 × 40 بكسل ، ويغطي كل بكسل 1.25 × 1.25 ميكرومتر مربع. اضبط وقت التعرض لكل طيف Raman على 1.5 ثانية وقم بتشغيل البرنامج النصي MATLAB. للمعالجة اللاحقة لخرائط رامان الفائقة الطيفية ، قم بتشغيل الأداة المستندة إلى الويب من RamApp. قم باستيراد البيانات الفائقة الطيفية بالنقر فوق جديد في علامة التبويب تحليلاتي وقم بتحميل ملف .mat الذي يحتوي على متغيرات البيانات المكانية والطيفية ، جنبا إلى جنب مع متغير المحور X. لاقتطاع الطيف، في قائمة الاقتصاص والتدوير، اختر اقتصاص طيفي. حدد الحدود السفلية والعليا لمنطقة تحول رامان على أنها 600 و 1,800 سنتيمتر عكسي على التوالي. لتصحيح الأشعة الكونية، انتقل إلى تقليل الإضاءة الكونية، وانقر فوق despike، وحدد Z-score كطريقة، واضبط العتبة على ثمانية. تحقق من الخيارات استخدام الفرق الأول والارتفاعات الصحيحة ، ثم انقر فوق تشغيل لتطبيق التصحيح. لإزالة الضوضاء من الخرائط، انقر على الخريطة السلسة، واختر عامل التصفية المتوسط، واضبط حجم المربع على ثلاث بكسل، ثم انقر على تشغيل. لتنعيم طيف كل بكسل، اختر مرشح Savistky-Golay. قم بتعيين طول نافذة الفلتر إلى سبعة وترتيب متعدد الحدود إلى اثنين، ثم انقر فوق تشغيل. لطرح متوسط إشارة الخلفية ، افتح إزالة الركيزة الضوئية وانقر فوق تحديد الركيزة. قم بتعيين k-means كطريقة مع مجموعتين. ثم انقر فوق خيارات متقدمة. اختر التنظيف المورفولوجي لإزالة النقط الصغيرة من المقدمة، ثم انقر فوق تشغيل. لإزالة متوسط إشارة الخلفية ، انقر فوق إزالة الركيزة ، ثم اختر المتوسط العام أو متوسط طريقة 95٪ المركزية من القيم وانقر فوق تشغيل. لتصحيح التألق الأساسي ، افتح لوحة خط الأساس ، وانقر فوق خط الأساس الصحيح ، وحدد النعومة التكيفية PLS ، ثم اضبط lambda على 5 ملايين وانقر فوق تشغيل. لتطبيع كل خريطة رامان فائقة الطيف، انتقل إلى متفرقات، وحدد تطبيع، واختر طريقة Frobenius، وانقر فوق تشغيل. لإنشاء صورة ملونة زائفة تعرض التوزيع تحت الخلوي، في لوحة الصور، انقر فوق رمز القائمة المفتوحة أسفل صورة الشدة، ثم انقر فوق تحرير الصورة. في لوحة التحرير، حدد النطاق الفردي وحدد النطاق الطيفي. الآن ، اختر لونا مزدوجا على خريطة الألوان ، ثم حدد اللون وعتبة الكثافة والتعتيم قبل النقر فوق تأكيد. لتنزيل طيف نقطة واحدة، اختر بكسل مثير للاهتمام، ثم في لوحة وسيلة الإيضاح الطيفية، انقر فوق تنزيل الطيف. أخيرا ، لتصدير أطياف المقدمة والركيزة ، انتقل إلى وسيلة الإيضاح الطيفية ، ثم انقر فوق تنزيل الطيف لكل من أقسام المقدمة والركيزة. ضع قطرة من الماء المقطر على العدسة الشيئية للمجهر. ضع العينة في مرحلة ترجمة المجهر، ثم اضبط موضع العينة لمحاذاة العدسة الشيئية. قم بتشغيل المجهر وقم بتشغيل برنامج التصوير. انقر فوق رمز المجهر على شريط الأدوات. بعد التهيئة، انقر فوق التكوين، وحدد الخلية الحية في لوحة الوظيفة وPBS كوسيط. بعد ذلك ، قم بالوصول إلى علامة تبويب المعايرة في لوحة التحكم الخاصة ببرنامج التصوير. اضبط المواضع المحورية للعدسات الموضوعية والمكثفة عن طريق تحديد التركيز البؤري والسطح على التوالي. الآن ، انقر فوق وضع المسح الضوئي لضبط العدسات يدويا والتأكد من أن أنماط الإضاءة متمركزة وثابتة تقريبا. اختر الوضع العادي ، ثم اضبط مرحلة الترجمة لإحضار الخلية إلى مجال الرؤية والتركيز على العينة. اضبط مرحلة الترجمة لتحديد موقع منطقة بدون خلايا. اختر المعايرة لالتقاط صور ثلاثية الأبعاد متعددة ثنائية الأبعاد بزوايا إضاءة مختلفة. اضبط مرحلة الترجمة لتوسيط الخلية ، ثم انتقل إلى علامة تبويب الاكتساب وحدد لقطة ثلاثية الأبعاد لالتقاط التصوير المقطعي للخلية. لتصور الصور المقطعية الثلاثية الأبعاد ، حدد البيانات الموجودة في لوحة تنقل البيانات ، وانقر بزر الماوس الأيمن ، وانقر فوق فتح. في لوحة إدارة البيانات ، انقر فوق التصوير المقطعي RI. في لوحة تصور وحدة التخزين، حدد RI وارسم أربعة مربعات ألوان مستطيلة داخل لوحة RI. قم بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم لنطاق RI لكل مربع لون، ثم قم بإقران التعتيم واللون مع كل مربع. انقر فوق حفظ لتخزين نطاقات RI ومربعات الألوان المحددة. للحصول على واصفات كمية لمورفولوجيا الخلية ، استخدم واجهة التحليل. حدد يدويا ضمن لوحة التجزئة، ثم قم بتعيين 1.3450 كحد RI وانقر فوق تطبيق. انقر فوق حفظ لحفظ الفهارس المورفولوجية المحسوبة. كشف رسم الخرائط الطيفية رامان عن التوزيع المكاني للسيتوبلازم والنواة والفينيل ألانين والدهون داخل خلايا MDA-MB-231 الفردية. تم تأكيد القمم الطيفية المميزة لرامان المقابلة للسيتوبلازم والنواة والفينيل ألانين والدهون في منطقة بصمات الأصابع بين 600 و 1,800 سم معكوس. كشفت خرائط معامل الانكسار الحرارية للخلايا المفردة عن التوزيع الداخلي للمكونات تحت الخلوية في المستوى المحوري XY ، ومستوى YZ السهمي ، وطائرات XZ الإكليلية. حددت إعادة البناء المقطعي ثلاثي الأبعاد مناطق معامل الانكسار الحجمي المقابلة للبنى التحتية الداخلية. أظهرت القياسات المورفولوجية الكمية لخلية MDA-MB-231 واحدة واصفات مختلفة لمورفولوجيا الخلية ، بحجم إجمالي قدره 4024.189 ميكرومتر مكعب ومساحة سطح تبلغ 2383.707 ميكرومتر مربع ، بمتوسط معامل انكسار 1.356.