Name: في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: اكتشف تقنية البيوتينيل القرب في Paramecium tetraurelia لدراسة تفاعلات البروتين في الجسم الحي باستخدام turboID. تتيح هذه الطريقة التخصيب الانتقائي للبروتينات المبيوتينيلة وتعزز فهم العمليات الجزيئية المعقدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+and+epigenetic+control+of+programmed+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).</li>
<li>Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStefanov%2C+B-A+%22Epigenetics+in+Biological+Communication.+Witzany%2C+G%22">Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G</a>. , Springer Cham. 369-385 (2024).</li>
<li>Dubois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+invasion+of+the+paramecium+germline+genome+countered+by+a+domesticated+piggybac+transposase+and+the+NHEJ+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway.</a> Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).</li>
<li>Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiosis-specific+Spt5+homolog+involved+in+non-coding+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).</li>
<li>Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+Dicer-like+proteins+and+small+RNAs+required+for+genome+sculpting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting.</a> Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).</li>
<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
<li>Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+noncoding+RNAs+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear noncoding RNAs and genome stability.</a> Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).</li>
<li>Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in Tetrahymena.</a> Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).</li>
<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
<li>Drews, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+piwis+with+Ago-like+functions+silence+somatic+genes+at+the+chromatin+level%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level.</a> RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI1+complex+proteins+facilitate+developmental+genome+editing+in+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium.</a> Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).</li>
<li>Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression%2C+solubility%2C+and+purification+of+a+passenger+protein+in+fusion+with+different+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags.</a> Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Beisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+clonal+Paramecium+tetraurelia+cell+lines+of+controlled+age+through+daily+reisolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).</li>
<li>Berger, J. D., Rahemtullah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+to+autogamy+in+Paramecium+blocks+mating+reactivity%3A+implications+for+regulation+of+the+sexual+pathway+and+the+breeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system.</a> Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).</li>
<li>Stefanov, B. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+thermometer+enables+precise+electrothermal+control+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
<li>Leffers, K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+natural+and+recombinant+prion+protein+into+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils.</a> Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+release+factor+1+from+Euplotes+promotes+frameshifting+at+premature+stop+codons+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells.</a> iScience. 27 (4), 109413(2024).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker-driven+feedback+control+of+synthetic+biology+systems+for+next-generation+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunlight-Controllable+Biopharmaceutical+Production+for+Remote+Emergency+Supply+of+Directly+Injectable+Therapeutic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins.</a> Small. 18 (41), e2202566(2022).</li>
<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>مجهر أكسيوفرت 40 CFL (عدسات 10x ، 40x)</td><td>زييس</td><td>نا</td><td></td></tr><tr><td>ب سيتوستيرول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل البقر (BSA)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>أ 9647</td><td></td></tr><tr><td>زيت سيل ترام</td><td>إبندورف</td><td>نا</td><td></td></tr><tr><td>كودون محسن تسلسل الحمض النووي 3xHA-turboID</td><td>تويست العلوم البيولوجية</td><td>نا</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTATCCTTACGAT GTTCCTGATTGCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAACbr/ TGAATTTCATTCTGGTGAACAA<C br/> TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGT TGATGTTTTTACTTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAATTTTTTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTTTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT TGGTATTGTTGGTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTa TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTGTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT / TCAAGAAGCTGGTAAATCTTGAT AGAAACACTTTAGCTGCTCTCA TTAGAGAACTTAGCTGCTTTA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGGATGGGAAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGGTGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>دابي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>د9542</td><td></td></tr><tr><td>إيدتا</td><td>فيشر العلمية</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>نصائح اللودر الصغير epT.I.P.S.</td><td>إبندورف</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>ايثانول</td><td>جروج كيمي</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>فيمتو جيت 4i</td><td>إبندورف</td><td>نا</td><td></td></tr><tr><td>الفيمتوبتيب الثاني</td><td>كاليبر ساينتفيك</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>محلول الفورمالديهايد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>إف 8775</td><td></td></tr><tr><td>الجلايسين</td><td>تطبيق كيم</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد IgG مضاد للأرانب ، أليكسا فلور 568</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>أ 11011</td><td></td></tr><tr><td>HA-tag (C29F4) أرنب mAB</td><td>أنظمة الخلايا</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>انجيكمان NI 2</td><td>إبندورف</td><td>نا</td><td></td></tr><tr><td>متوسط خفيف</td><td>نا</td><td>نا</td><td>محلول مسحوق عشب القمح 0.2x في 2.5 ملي Na 2 HPO4</td></tr><tr><td>الزيوت المعدنية</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>إم 8691</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>الفينول - الكلوروفورم - إيزوميل ألكوهول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>الفوسفور محلول ملحي مخزن&nbsp;</td><td>فيشر العلمية</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>طقم البلازميد بالإضافة إلى midiprep</td><td>كياجيني</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>وسط غني</td><td>نا</td><td>نا</td><td>1x محلول مسحوق عشب القمح في 2.5 ملي Na 2 HPO4</td></tr><tr><td>ستريبتافيدين-FITC</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>مرشح الطرد المركزي Ultrafree-MC GV &nbsp ؛</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>محلول الغسيل</td><td>نا</td><td>نا</td><td>0.1٪ BSA في مياه Volvic&nbsp;</td></tr><tr><td>محلول مسحوق عشب القمح</td><td>باينز الدولية</td><td>نا</td><td>قم بإعداد مخزون 20x من المسحوق كما هو موضح سابقا (0.5 جم / 10 مل)</td></tr><tr><td>ستريبتافيدين-HRP</td><td>أبكام</td><td>أب7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin المغلفة الخرز magnatic</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>المخزن المؤقت للتحلل للسحب</td><td>نا</td><td>نا</td><td>50 ملي تريس درجة الحموضة 8 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم; 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم. 1٪ تريتون X-100 ؛ 5 مللي مولار MgCl2; 2x مثبطات البروتياز cOmplete (روش) ؛ &nbsp;</td></tr><tr><td>مخزن الغسيل 1 للسحب</td><td>نا</td><td>نا</td><td>50 ملي تريس درجة الحموضة 8 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم; 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم. 1٪ تريتون X-100 ؛ 5 مللي مولار MgCl2;</td></tr><tr><td>مخزن مؤقت للغسل 2 للسحب</td><td>نا</td><td>نا</td><td>10 ملي تريس درجة الحموضة 7.4 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم; 0.01 ٪ NP40; 1 ملي مللي كلوريد 2</td></tr><tr><td>عازلة الغسيل 3 للسحب</td><td>نا</td><td>نا</td><td>10 ملي تريس درجة الحموضة 7.4 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم;</td></tr></tbody></table>

في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في paramecium tetraurelia

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

يصف بروتوكولنا طريقة مبسطة لإدخال تعديل البيوتين التساهمي للبروتينات الموجودة بالقرب من البروتين المستهدف في Paramecium (الشكل 1 أ). يمكن بعد ذلك إثراء هذه البروتينات البيوتينيل بشكل أكبر باستخدام سحب الستربتافيدين وتحديدها باستخدام قياس الطيف الكتلي20. لإثبات حالة استخدام عملية للطريقة ، قمنا بتطبيق البروتوكول على بروتين Nowa1. هذا البروتين ضروري لعملية إعادة الترتيب الجيني وله تغييرات ديناميكية في توطينه12. في المراحل المبكرة ، يبقى في النواة الجسدية القديمة والشظايا ، ولكن لاحقا يقع في النواة النامية الجديدة. والجدير بالذكر أن محاولاتنا السابقة لإثراء البروتينات المتفاعلة بوساطة العلامة لم تنجح (نتائج غير منشورة). كان هذا على الأرجح بسبب التكرارات المعقدة التي تحمل تشابها مع بروتين البريون PrP27 الذي يمكن أن يتسبب في التجميع الذاتي في ظل ظروف غير مثالية أثناء إجراء السحب21. قمنا بتضخيم PCR منطقة ترميز Nowa1 جنبا إلى جنب مع منطقتها غير المشفرة التي تحتوي على المروج. ثم تم إدخال المنتج في الإطار بتسلسل ترميز turboID محسن للكودون (الشكل 1 ب). لتجنب الإسكات الناجم عن الجينات المعدلة وراثيا الناجم عن حقن الحمض النووي الدائري في Paramecium، تم خطية الناقل قبل الحقن. ثم تم حقن الحمض النووي الخطي والمنقي في النواة الجسدية (MAC) كما هو موضح في هذا البروتوكول. أصبحت قطرة متناثرة محصورة داخل المنطقة المظلمة من النواة الجسدية مرئية في بعض الحقن الناجحة (الشكل 1 ج). ثم تم التحقق من الحقن الناجح وتضخيم الحمض النووي بواسطة الخلايا أثناء انقسام الخلايا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كما هو متوقع ، كانت 40-50٪ من الخلايا إيجابية للحمض النووي المحقون لبناء Nowa1 (حجم المنتج المتوقع 685 نقطة أساس) (الشكل 2). كانت الخطوة التالية هي التحقق من وجود البروتين المشفر بواسطة الحمض النووي المحقون. نظرا لأن متجه المتلقي يحتوي على تسلسل turboID محاط بعلامة HA ثلاثية ، فقد استخدمنا تلطيخ التألق المناعي للكشف عن العلامة. سمح لنا ذلك بالتحقق مما إذا كانت الخلايا المحقونة تعبر عن بروتين الاندماج وما إذا كانت مترجمة بشكل صحيح. استخدمنا خلايا المرحلة المتأخرة التي أظهرت توطين بروتين الاندماج في النواتين الناميتين الجديدتين ، كما لوحظ سابقا لبروتين Nowa1 من النوع البري12. أظهرت خطوط الخلايا الفردية المحقونة مستويات مختلفة من بروتين الاندماج (الشكل 3). يمكن أن يكون مستوى التعبير المنخفض مفيدا للتطبيقات التي يكون فيها انخفاض الخلفية مرغوبا فيه ، ولكن في هذه الحالة ، اخترنا الإشارة القصوى وشرعنا في الاستنساخ 2 ، والذي أظهر أعلى تعبير. ثم جمعنا عينات خلال مراحل النمو المختلفة لتتبع توطين بروتين الاندماج. تم توطين البروتين في البداية في الأسطح المتكونة من النواة الجسدية القديمة وفي الأجزاء النووية المنفصلة خلال المراحل الأولى من الزواج الذاتي. عند ظهور الأنلاجين النووي ، انتقل بروتين الاندماج نحو هذه النوى النامية الجديدة (الشكل 4). لتعزيز البيوتينيل للبروتين القريب في المراحل المختلفة ، قمنا بتكمل المزرعة ب 500 ميكرومتر من البيوتين لمدة ساعتين قبل حصاد الخلايا ل IF. لقد تصورنا البروتينات المسماة بالبيوتين عبر تلطيخ IF باستخدام الستربتافيدين الموسوم بالفلورسنت. تتوافق الإشارة المرصودة مع توطين بروتين الاندماج الموسوم ب HA. الأهم من ذلك ، كان من الممكن الحصول على توطين البيوتينيل الخاص بمراحل النمو النووي المختلفة ، حيث أن الحضانة القصيرة مع البيوتين كافية لتحقيق بيوتينيل كبير (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، بدون إضافة البيوتين التكميلي ، كان من الممكن اكتشاف البيوتينيل الضئيل فقط في الخلايا المحقونة. في الخلايا من النوع البري ، تسببت إضافة البيوتين التكميلي في عدم اكتشاف البيوتينيل (الشكل 5 أ). والجدير بالذكر أن البيوتين لم يكن يتراكم فقط في النواة النامية ، لأنه حتى في ظروف تغيير طبيعة ، فإنه يظل مرتبطا بالبروتينات. (الشكل 5 ب). باستخدام الخرز المغناطيسي المطلي بالستريبتافيدين ، كان من الممكن إثراء البروتينات البيوتينيل بشكل انتقائي (الشكل 6). يمكن التعرف على البروتينات المخصبة باستخدام قياس الطيف الكتلي. في تجارب تحديد البروتين اللاحقة هذه ، يمكن استخدام الثقافة غير المكملة ، وكذلك الخلايا التي تعبر عن بروتين turboID غير المنصهر ، كمجموعات تحكم في الخلفية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
الشكل 1: نظرة عامة على إجراء البيوتينيل القريب في P. رباعي الحالة. (أ) المخطط المعمم للبروتوكول. (ب) مبدأ الاستنساخ لمتجه مستلم turboID للتوصيل والتشغيل والبناء الناتج لبروتين الاندماج Nowa1. منطقة 3'UTR المستخدمة في هذا البلازميد مشتقة من CenH3a. (ج) قطرة منتشرة مرئية موجودة داخل المنطقة الداكنة المقابلة للنواة الجسدية (MAC) عند الحقن الناجح للحمض النووي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
الشكل 2: اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للحقن الناجح. تحليل هلام الاغاروز لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنتج مع برايمر أمامي خاص بترميز منطقة المنبع لمقاومة الأمبيسلين (بدء الأمبير) وبرايمر عكسي مكمل ل Nowa1. يظهر رأس السهم حجم المنتج المتوقع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
الشكل 3: تلطيخ التألق المناعي للتحقق من صحة التوطين الصحيح لبروتين الاندماج turboID. تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة الأولية للأرانب المضادة لحمض الهيالورونيك (1: 100) والأجسام المضادة الثانوية المترافقة من الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 568 (1: 1000) من خطوط Paramecium أحادية النسيلة مع إشارة تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية للحمض النووي الذي يشفر بروتين اندماج Nowa1-HA-turboID. مقياس 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
الشكل 4: البيوتينيل الخاص ب Nowa1 في مراحل النمو المختلفة. تلطيخ التألق المناعي للخط أحادي النسيلة 2 في مراحل متقدمة أثناء تكوين النواة الجسدية الجديدة. تم استكمال وسط الاستزراع ب 500 ميكرومتر من البيوتين للحصول على نشاط turboID الأمثل. تم الكشف عن علامة HA كما في الشكل 3 ، وتم الكشف عن البيوتين باستخدام Streptavidin-FITC (1: 200). مقياس 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
الشكل 5: يتطلب وضع العلامات الفعالة على القرب بواسطة turboID البيوتين التكميلي في الثقافة. (أ) تلطيخ التألق المناعي للخلايا بالوزن والخلايا المحقونة في مرحلة النمو المتأخرة مما يدل على التعبير عن Nowa1-HA-turboID والبيوتينيل الملحوظ مع 500 ميكرومتر من البيوتين التكميلي. تم الكشف عن علامة HA والبيوتين كما في الشكل 4. مقياس 20 ميكرومتر. (ب) تحليل اللطخة الغربية للبيوتين باستخدام HRP-streptavidin لخلايا WT المزروعة بخلايا حقن 500 ميكرومتر من البيوتين والخلايا المحقونة TurboID مع البيوتين وبدونه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
الشكل 6: إثراء البروتينات البيوتينيل بخرز الستربتافيدين المغناطيسي. تحليل اللطخة الغربية للبيوتين لعينات من تجربة منسدلة باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالستريبتافيدين. العينات هي: Nowa1-HA-turboID خلية محللة (إدخال) ، والجزء غير المرتبط (التدفق) ، وخطوات الغسيل (الغسيل 1-6) ، والبروتينات المرتبطة بالخرز (الإخراج). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هذا الفيديو يبين تحليل التجارب مع لاحقة من البروتين البروتين التفاعلات عن طريق استخدام الصغرى منقوشة السطوح. النهج توفر إمكانية الكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية ، ويجمع بين قدرات إنتاجية عالية مع إمكانية استخراج المعلومات الكمية.

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

هذا البروتوكول صورة توضح كيفية البروتين البروتين التفاعلات باستخدام مقايسة القرب الحنق مقرا لها.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

يصف هذا الفيديو مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع في خلايا الديدان الخيطية. يؤدي القرب الشديد من البروتينات ذات الأهمية إلى إنشاء قالب الحمض النووي الدائري بمساعدة مسبار PLA المتصل بجسم مضاد ثانوي. يتم تضخيم المسبار بشكل أكبر باستخدام محلول التضخيم ، والذي ينتج حمض نووي طويل أحادي الشريطة متبوعا بتهجين مسبار الكاشف ، مما يتيح توطين تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا.

مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع

هنا، نحن تصف الإجراء لتصور وقياس مع حساسية عالية التفاعلات الذاتية بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الثابتة. يتميز البروتوكول والأمثل في الموقع قرب ربط فحص استهداف إينوزيتول 1،4،5-ثلاثي مستقبلات / التنظيم الجلوكوز البروتين 75 / قناة أنيون / cyclophilin مجمع تعتمد على الجهد D في واجهة غشاء المرتبطة الميتوكوندريا.

دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة

ويصف هذه المخطوطة البروتوكول "تنقية تقارب التكامل بيموليكولار" (بيكاب). يسهل هذا الأسلوب رواية عزلة محددة وتوصيف البروتين المصب أي اثنين من البروتينات المتفاعلة، بينما استبعاد الأمم المتحدة الرصاصية البروتينات الفردية، فضلا عن مجمعات شكلت مع الشركاء ملزمة المتنافسة.

تشريح مجمعات البروتين متعدد الإشارات بالتكامل Bimolecular انجذاب تطهير (بيكاب)

نقدم هنا بروتوكولا لرصد الجمعية والتفكيك من توكسين الأنثراكس باستخدام قياس التداخل بيولايير (BLI). بعد التجميع/التفكيك على سطح بيوسينسور، تصدر مجمعات البروتين الكبيرة من على سطح الأرض للتصور وتحديد مكونات المجمعات باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي، على التوالي.

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

تُعرض هنا بروتوكولات للاختبارات البيوكيميائية في المختبر باستخدام ملصقات البيوتين التي قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة تفاعلات حمض البروتين والنوى.

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.

في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) هو تقنية تصوير للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول FRET لدراسة ارتباط الإنزيمات المعدلة للهيستون بعوامل النسخ التي تجندها إلى المروجين المستهدفين للتنظيم اللاجيني للتعبير الجيني في الأنسجة النباتية.

دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ في الجسم الحي عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري

في هذه الدراسة ، أنشأنا بروتوكولا مفصلا لوضع العلامات القريبة المستندة إلى TurboID (PL) في D. melanogaster المبيض ، يغطي الخطوات من مكملات البيوتين وتشريح المبيض إلى التحقق من صحة التعبير الجيني وإثراء الببتيدات الحيوية لقياس الطيف الكتلي.

في الجسم الحي تطبيق وضع العلامات على القرب المستندة إلى TurboID في ذبابة الفاكهة السوداء

اكتشف تقنية البيوتينيل القرب في Paramecium tetraurelia لدراسة تفاعلات البروتين في الجسم الحي باستخدام turboID. تتيح هذه الطريقة التخصيب الانتقائي للبروتينات المبيوتينيلة وتعزز فهم العمليات الجزيئية المعقدة.

في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia

استكشف المزيد من الفيديوهات