التصوير المقطعي بالفحص المجهري الإلكتروني في علم الفيروسات: التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات المجمدة عالية الضغط والاستبدال بالتجميد

يمكن أن تسبب العدوى الفيروسية تغييرات كبيرة في البنية الخلوية. لرؤية هذه التغيرات في ثلاثة أبعاد، نستخدم التصوير المقطعي STEM لتصوير الخلايا المصابة بالفيروس. التصوير المقطعي للعلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات يستغرق وقتا طويلا ويتطلب جهدا كبيرا.

وهذا يجعل تحضير العينات المثلى أمرا ضروريا للعينات البيولوجية، مثل المجموعات المصابة بالفيروسات. يقتصر التصوير المقطعي التقليدي للعلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات على عينات الأمراض التي تبلغ حوالي 200 نانومتر. يتيح بروتوكولنا التصوير ثلاثي الأبعاد للأجزاء السميكة.

يتيح ذلك رؤية أكثر شمولا للخلايا المصابة بالفيروس والتغيرات الهيكلية الفائقة. العديد من الفيروسات المسببة للأورام هي في الأصل تجارب سريرية بالفعل، لذلك يعمل الباحثون والمطورون حول العالم معا، والعلم يدفع حدود علاج السرطان، وتساهم الطرق الحديثة مثل المجهر الإلكتروني والتصوير المقطعي STEM برؤى جديدة. سنواصل الإجابة على الأسئلة الفيروسية باستخدام التصوير المقطعي STEM ودمجها مع بروتوكولات تحضير جديدة وتقنيات مجهرية أخرى.

للبدء، ملء صندوق النيتروجين السائل استعدادا للتعامل مع أقراص الياقوت المجمدة ونقلها من حامل التجميد عالي الضغط أو حاملة HPF إلى كبسولات التخزين. احتفظ بديوار مملوء بالنيتروجين السائل بالقرب منه لإعادة تعبئة صندوق LN حسب الحاجة أثناء عملية التجميد. احتفظ بملقط معزول جاهزا.

جهز حاويات العينات التي ستحتفظ بأقراص الياقوت بعد الحمض العالي الوريدي (HPF). تأكد من وجود غطاء وعدة فتحات لتدفق النيتروجين السائل وأوزان صغيرة لضمان عدم الطفو. ضع علبة الملصق في علبة LN لتبريده مسبقا قبل الاستخدام.

ثم ضع العينات في الحاضنة. افحص أقراص الياقوت تحت مجهر ضوئي مقلوب لضمان وجود عدد كاف من الخلايا وجودة الخلايا الجيدة قبل بدء التجميد بالضغط العالي. لإجراء الحمض النووي الوريدي الوريدي، خذ قرص ياقوت واحد من طبق الزراعة وادهنه بسرعة على ورق المرشح لإزالة الوسائط الزائدة.

ضع القرص في حامل HPF بحيث يكون الجانب المطلي بالكربون مواجها للأعلى، لضمان أن الرقم اثنين قابل للقراءة. اغمس فاصل ذهبي في الهيكساديكان وضعه برفق على قرص الياقوت. ضع قرص ياقوت ثاني فوق الفاصل بحيث يكون الجانب المطلي بالكربون مواجها للأسفل لتشكيل تكوين ساندويتش بحيث تتجه الخلايا نحو بعضها البعض، والتأكد من عدم وجود هواء محبوس.

أغلق حامل HPF بعناية وسرعة لتقليل الضغط على العينة. أدخل حامل HPF في الفريزر عالي الضغط. قم بقفله وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وابدأ عملية التجميد.

بعد ذلك، انقل حامل HPF إلى صندوق LN. ثم انقل الطرف الذي يحمل أقراص الياقوت إلى صندوق LN الذي كان يبرد مسبقا. استخرج الأقراص بعناية من الحامل.

ضع القوارير المغلقة المملوءة بمحلول الاستبدال الحر في جهاز استبدال حر مبرد مسبقا إلى ناقص 90 درجة مئوية. انتظر حتى يصل المحلول إلى نفس درجة الحرارة. الملقط قبل التبريد، المشرط والكماشة أو الملقط الكبير عن طريق غمرها في النيتروجين السائل لاستخدامها في نقل أقراص الياقوت.

انقل العينات المجمدة ذات الضغط العالي إلى جهاز الاستبدال الحر. افصل أقراص الياقوت واحدة تلو الأخرى، مع الحفاظ عليها في النيتروجين السائل. ونقل كل قرص بسرعة بشكل فردي إلى قارورة تجميد مع محلول استبدال مجاني، لضمان غمر القرص بالكامل.

بعد إغلاق القارورة التجميدية، أعدها فورا إلى جهاز الاستبدال الحر. بمجرد وضع جميع العينات، ابدأ عملية الاستبدال. بمجرد أن تصل العينات إلى 20 درجة مئوية.

استمر في غسل العينات ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منها بنسبة 100٪ أسيتون. لتضمين العينات مسبقا، يتم حضن العينات في ثلث راتنج الإيبوكسي وثلثي الأسيتون لمدة ساعة. بعد حضنة العينات بثلثي راتنج الإيبوكسي وثلث الأسيتون لمدة ساعة، وتبادل المحلول مع راتنج الإيبوكسي 100٪ وحضنه طوال الليل مع فتح غطاء القارورة للسماح للتبخر المتبقي للأسيتون في اليوم التالي، ثم نقل أقراص الياقوت إلى أنابيب تفاعل جديدة معنونة مملوءة براتنج الإيبوكسي الطازج.

ضع الأقراص أفقيا مدعوما بجدار الأنبوب، لضمان أن الجانب الذي يحتوي على الخلايا مواجها للأعلى. ثم ضع أنابيب التفاعل مع فتح الأغطية في فرن مضبوطا على 60 درجة مئوية ودع الراتنج يبلمر لمدة لا تقل عن 48 ساعة. بعد أن يبلمر راتنج الإيبوكسي، يغمر طرف أنبوب تفاعل مغلق في النيتروجين السائل لمدة تقارب 10 ثوان.

اضغط على أنبوب التفاعل على طاولة لتحرير كتلة الراتنج. سينفصل قرص الياقوت بسهولة عن الطبقة الكربونية، التي تبقى ملتصقة بالخلايا المدمجة. اختر منطقة الاهتمام في العينة المدمجة وضيق حجم العينة إلى منطقة الاهتمام.

باستخدام ميكروتون فائق الميكروتون مع سكين ألماس، اجمع مقاطع بسماكة حوالي ميكرومتر واحد على شبكة قضبان متوازية مشحونة بالبولي-إل-ليسين لتصوير STEM والتصوير المقطعي STEM. عالج الأقسام بالذهب الغروي كعلامات ائتمانية وطبق طبقة كربونية. بعد قطع وفحص المقاطع فائقة الرقيقة، تكون العينات جاهزة للتصوير.

استنادا إلى سؤال البحث، أدرج إما كاشف المجال الساطع، أو كاشف المجال المظلم، أو كلاهما. فعل وضع المسح واحصل على صورة اختبار للعينة. اختر تكبيرا أعلى من 800,000 مرة، وهو أكبر من التكبير النهائي المطلوب.

بالقرب من منطقة الاهتمام، قم بضبط التركيز وصحح الاستجماتيزم مع تجنب التعرض المباشر للشعاع على المناطق الحرجة من العينة. اضبط الارتفاع الغريب بحيث يبقى العائد على الاستثمار، أو منطقة الاهتمام، مركزة في نطاق الإمالة. اختر ميزة قريبة من العائد على الاستثمار، وزعها إلى المركز، وركز، صحح الاستجماتيزم، واميل المرحلة خطوة بخطوة إلى ناقص 72 درجة.

لاختيار مجال الرؤية، انتقل مرة أخرى إلى عائد الاستثمار، وضعه في التركيز، والتقط صورة عامة. حدد التكبير النهائي المطلوب للحصول على سلسلة الإمالة. قم بإعداد التقاط الصور بشكل تلقائي بسلسلة ميلان، تتراوح من ناقص 72 درجة إلى زائد 72 درجة، والصورة كل 1.5 درجة.

ابدأ عملية الاستحواذ التلقائية على سلسلة الميل. أوضحت الشرائح الافتراضية الممثلة من مخطط الحرارة STEM كيف يؤثر اتجاه الفيروسات على رؤية شكل الرصاصة المميز في العروض ثنائية الأبعاد. ظهرت فقط الفيروسات المصطفة بشكل موازي لمستوى الرؤية مع شكل الرصاصة المحدد جيدا، بينما بدت أخرى دائرية أو ممدودة حسب زاوية ميلها.

لتجاوز قيود التوجيه في التصوير ثنائي الأبعاد، تم استخدام التصوير المقطعي STEM لالتقاط مجموعات كبيرة من فيريون فيروس التهاب الفم الحويصلي المؤتلف، مما أتاح تقييم شكل الفيروسات في ثلاثة أبعاد دون تحيز اتجاهي. أكد العرض الجانبي للترموجرام الميزة الحجمية للتصوير المقطعي STEM الذي يلتقط العديد من الفيروسات الكاملة ضمن مقطع واحد بسماكة 600 نانومتر، على عكس العينة المحدودة الممكنة في قسم TEM بحجم 200 نانومتر.