تضخيم الحمض النووي الريبي الصغير والتعرف عليه من خلال التهجين الموضعي الموضعي كطريقة جديدة للكشف والقياس الكمي

كان نطاق بحثنا هو تطوير والتحقق من اختبار يكتشف ويقيس في الوقت نفسه ميكروRNA وعدة بروتينات داخل نسيج FFPE لمراقبة العلاقة مكانيا بين الاثنتين داخل نسيج TME. في الواقع، يتغلب على القيود الشائعة في التسلسل الجزيئي الحالي والتقليدي من خلال توفير قياس مباشر، وتحديد موقع، واكتشاف مكاني متزامن للميكروRNA والبروتينات، وكل ذلك دون تدمير الأنسجة والحفاظ على تحديد الموقع الخلوي وتحت الخلوي. وقد تمهد هذه التقنية الطريق للأبحاث الأساسية في الشبكات التنظيمية، وآليات الأمراض، والدراسات السريرية أو الترجمية التي تبحث عن مؤشرات حيوية أفضل وأهداف علاجية.

ابدأ بإزالة عينات من ورم مبيض بشري مثبتة بالبارافين من الورم، محفوظة طوال الليل عند 60 درجة مئوية. باستخدام مياه خالية من RNAse، نظف جميع المعدات والأدوات بشكل جيد. بعد ذلك، لإجراء إزالة البارافين، اغمر العينات في الزيلين ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها.

أعد ترطيب الأنسجة بعشر جولات من سلسلة الإيثانول المخفف المتتالية، كل واحدة لمدة ثلاث دقائق. ثم اغسل العينات مرة واحدة في الملعقة الصبغية لمدة دقيقتين. ضع محلول بيروكسيد بنسبة 3٪ على العينات لمدة 10 دقائق.

اغسل العينات مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما باستخدام TBS. ثم ضع محلول بارافورمالديهايد بنسبة 3.7٪ لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ابدأ الجولة الأولى من استرجاع المستضدات باستخدام نظام الأشعة تحت الحمراء Easy Retrever.

اغمر الشرائح في مخزن مؤقت EZ-AR 1 الطازج، وقم بتسخين الميكروويف على 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم اشطف العينات في TBS لمدة دقيقتين، ثم غسلتين دقيقتين في TBST. للبدء، ارسم حاجزا حول كل جزء من الأنسجة باستخدام قلم حاجز كاره للماء.

أضف محلول حجب الأجسام المضادة وحضن الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة. الآن، ضع الجسم المضاد الأساسي المخفف في نفس محلول الانسداد لتغطية قسم الأنسجة بالكامل وحضنه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة. بعد غسل الشرائح ثلاث مرات في TBST، أضف محلول بيروكسيداز مضاد للفأر والأرنب لتغطية الأنسجة واحتضان في غرفة الرطوبة على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

الآن، قم بتخفيف أول فلورو-4 بنسبة 1:100 باستخدام مخفف التضخيم. ضع هذا الخليط على النسيج وحضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة، مع تجنب التعرض المباشر للضوء. بعد إجراء الجولة الثانية من سحب ومنع المستضدات كما هو موضح سابقا، قم بتخفيف الجسم المضاد الأولي الثاني بنفس محلول الحظر.

ضع الجسم المضاد المخفف لتغطية كامل قسم الأنسجة وحضنه طوال الليل لمدة لا تقل عن 16 ساعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية داخل غرفة الرطوبة. في اليوم التالي، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منها في TBST وحضنها بمحلول بيروكسيداز مضاد للفجل الحار من الفأة والأرنب كما هو موضح سابقا. ثم ضع الفلورو-4 الثاني المخفف على الشرائح وحضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة.

لوضع المجوس، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منها في TBST. لبدء سحب المستضدات الثالث والأخير، اغمر الشرائح في مخزن EZ-AR 1 Elegance، وقم بتسخين الميكروويف على حرارة 107 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. برد الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل غسلها مرة واحدة لمدة ثلاث دقائق في القرص الخفيف (TS).

ضع كمية كافية من RNAscope Protease Plus لتغطية منطقة الأنسجة وحضن الرطوبة عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام الفرن. ثم سخن مسبار الحمض النووي المغلق بالميكروRNA إلى 90 درجة مئوية لمدة أربع دقائق لتفكيكه. قم فورا بتخفيف المسبار المغير بمحلول microRNA في الموقع.

بعد الدوران وتدوير المسبار المعد، أضفه ليغطي كامل منطقة الأنسجة وحضنه لمدة ساعة في حرارة 60 درجة مئوية في الفرن. اغسل الشرائح مرة واحدة لمدة خمس دقائق باستخدام مخزن SSC 5x. قم بخمس غسلات صارمة عند 60 درجة مئوية باستخدام SSC Buffer لمدة خمس دقائق لكل منها.

ثم اغسل الشرائح مرة واحدة لمدة خمس دقائق بدرجة حرارة 0.2 مرة SSC في درجة حرارة الغرفة. لتحضير محلول الحجب، اجمع بين TBS ومسحوق كاشف الانسداد بنسبة 0.5٪. ضع حاجز العزل واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.

بعد ذلك، ضع مضاد الديجوكسين وبيروكسيداز الفجل الحار المتصل بالفئران، وحضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. بعد ثلاث غسلات TBST، قم بتخفيف إشارة التيراميد بنسبة 1:50 بالإضافة إلى السيانين 3 على الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة. اغسل الشرائح ثلاث مرات أخرى لمدة خمس دقائق لكل منها في TBST.

ضع كمية كافية من محلول DAPI العامل المخفف بنسبة 1:1000 في TBS لتغطية قسم الأنسجة بالكامل. حضن الزلاجات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة مع رطوبة محيطة. اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في TBST.

ضع شرائح الغطاء باستخدام وسائط التثبيت واترك الشرائح تجف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخزين الشرائح المجففة عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 24 إلى 72 ساعة قبل التصوير أو حتى ثلاثة أشهر للتخزين لفترة طويلة. تم اكتشاف تعبير miRNA ل miR-181c-3p بشكل مستمر في كل من شرائح التحكم وشرائح الأجسام المضادة المصبوغة، مع تركيز إشارات أقوى بشكل واضح في مناطق خلايا الورم.

أدى تطبيق الجسم المضاد المضاد EpCAM مع فلوروفور انبعاث 620 نانومتر إلى صبغ خلايا الورم في عينة HGSC. تطبيق الجسم المضاد المضاد ل CD8 مع فلوروفورات انبعاثية بحجم 620 نانومتر كان محددا بوضوح لخلايا T إيجابية CD8. مكن الكشف المشترك بين البروتين والmiRNA من تحديد موقع miR-181c-3p المكاني بالنسبة لخلايا الورم الإيجابية ل EpCAM والخلايا المناعية الإيجابية ل CD8.

أنتج مسبار التحكم الإيجابي الذي يستهدف الحمض النووي الريبي النووي الصغير U6 إشارات فلورية قوية عبر جميع أنواع الأنسجة، مما يؤكد فعالية المجس وسلامة الأنسجة. أظهر المجس السلبي الذي استخدم تسلسل miRNA مشوش عدم وجود إشارة قابلة للكشف في أي نوع من الأنسجة، مما يشير إلى عدم وجود ارتباط غير محدد. أظهر المجس المستهدف ل miR-181c-3p تعبيرا قويا في نسيج السرطان المصلي عالي الدرجة دون أي إشارة في نسيج المبيض الطبيعي أو نسيج قناة فالوب الطبيعي، مما يدل على خصوصية ودقة المسبار والاختبار.