التحديد الهيكلي بدقة دون النانومتر للهيماجلوتينين من التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لفيروسات الأنفلونزا

يستخدم مختبرنا علم الأحياء البنيوي لدراسة الفيروسات وتطور مقاومة الأدوية. في العمل الحالي، نصف كيف يغير الهيماغلوتينين الإنفلونزا الشكل عند ارتباط المستقبلات. لقد استفدنا من التصوير المقطعي بالإلكترونات بالتبريد لتصوير الشكل الفيروسي وتنظيمه وبنيةه.

على وجه التحديد، استخدمنا هذه الطريقة من المجهر الإلكتروني البارد لتصوير إنفلونزا الفيروس متعدد الشكل. يسمح لنا بروتوكولنا بدراسة تنظيم وبنية هيماغلوتينين الإنفلونزا في الموقع على الفيروسات السليمة بدقة أقل من النانومتر. تسمح لنا هذه الدقة الأعلى بتصور التفاعلات التي كانت مخفية سابقا.

للبدء، قم بتشغيل محطة لينكس لتفعيل بيئة Conda. استخدم الطرفية لتفعيل بيئة كوندا مع تثبيت شبكة ISO. أنشئ مجلد فرعي باسم مجلد تومو، ثم انقل جميع ملفات التوموغرام إلى ذلك المجلد.

بعد ذلك، استخدم الكود لإنشاء ملف نجمة في مجلد المشروع. باستخدام محرر نصوص، افتح ملف النجمة المتولد وأدخل قيمة إزالة التركيز التقريبية للصور ذات الميل الصفري في العمود الرابع. الآن شغل أمر الالتفاف CTFD في المحطة.

بعد فك الالتفاف، قم بتفعيل بيئة واجهة المستخدم الرسومية EMAN2 لبدء المعالجة المسبقة لالتقاط الجسيمات. تحت التصوير المقطعي، انقر بزر اليسار على السهم بجانب البيانات الخام، اختر استيراد الصور المصورة من القائمة المنسدلة، واختر الملفات. ثم، انقر بزر اليسرى على السهم بجانب التقسيم واختر الصور المقطعية المعالجة مسبقا.

استخدم المعايير الافتراضية المناسبة. بعد المعالجة المسبقة، سيتم إنشاء مجلد معلومات يحتوي على ملفات JSON فارغة تطابق أسماء أساسيات ملفات التصوير المقطعي للعملية تلقائيا. أضف معلومات بكسل الأنغستروم إلى الملفات قبل المتابعة.

لتدريب شبكة عصبية الالفافية، أو CNN على التعرف على بروتين HA، قم بتغيير دليل العمل إلى موقع الصور المقطعية المستخدمة. ثم افتح واجهة تدريب CNN باستخدام المحطة. تأكد من أن أربعة نوافذ مفتوحة.

واحدة تحتوي على معلومات عن معلمات CNN والتصوير الطيني في الدليل، والنوافذ الثلاث الأخرى تحتوي على صور للمراجع الجيدة والسيئة والجسيمات التي يختارها CNN. في واجهة CNN الرسومية، انقر على الخيار الجديد لتهيئة CNN بمعدل تعلم افتراضي 0.0001 وحجم صندوق ثمانية. تحت عمود اسم الملف، انقر بزر الأيسر على صورة مصورة ممثلة لفتحها.

مرر المؤشر فوق المخطط المقطعي المفتوح واضغط على عجلة تمرير الماوس لفتح نافذة جديدة. انقر بزر اليسار على شريط الرقم N لعبور محور Z. بعد ذلك، في المخطط المقطعي المفتوح، استخدم لوحة المراجع الجيدة لاختيار 10 إلى 20 ميزة تتوافق مع HA. تظهر الصور الإيجابية في نافذة الإيجابية.

لإزالة أحدهم، اضغط باستمرار على Shift وانقر عليه بزر الأيسر. الآن انتقل إلى لوحة المراجع السيئة واختر من 10 إلى 20 مرجعا تتوافق مع ميزات مثل رقع الغشاء الفارغة، كثافة RNP، العلامات الائتمانية، والحطام. اضبط عدد التكرارات إلى 50 وانقر على أيقونة القطار لبدء تدريب CNN.

بعد الانتهاء من التدريب، اضغط على التطبيق. سيتم عرض الجسيمات المختارة على التصوير المقطعي كدوائر زرقاء أو يمكن رؤيتها في نافذة الجسيمات. واصل التحسين باختيار مراجع إيجابية وسلبية إضافية، مع النقر الدوري على الحفظ للحفاظ على التقدم.

بمجرد أن يعمل CNN بشكل مرض، اضغط على تطبيق الجميع لتشغيل جمع الجسيمات. ثم قيم النتائج في عدة تصوير مقطعي وأعد تدريبه حسب الحاجة. لحفظ الإحداثيات لكل مخطط طمطري، أعد فتح واجهة المستخدم الرسومية EMAN2 باستخدام الأمر e2projectmanager.py.

انقر على السهم تحت متوسط المخطط الفرعي واختر الملاكمة اليدوية. الآن، أدخل اسم النموذج المقطعي واضغط على الإطلاق. ثم، انقر على الملف بشكل تسلسلي، وحفظ سلك الصندوق، و tomogram_ha.

رسالة نصية لحفظ الإحداثيات. انتقل إلى مجلد الشبكة العصبية ومجلدات المعلومات للنسخ الاحتياطي والحفظ عبر الإنترنت. HDF، تدريبات.

HDF، القطع المنفصلة. hdf، و boxes3Dref.hdf. درب CNN ثانية على اكتشاف طبقة بروتين M1 ووجود VRNP عن طريق تغيير حجم صندوق التدريب من ثمانية إلى 14.

لتنسيق الجسيمات، قم أولا بتحميل دفاتر من مستودع GitHub. ثم افتح جهاز CNN لتنظيف جسيمات ال IPYNB، وحمل الوحدات المطلوبة. قم بتحميل ملفات الإحداثيات HA وM1 في الدفتر.

شاهدها كسحب ثلاثية الأبعاد باستخدام مكتبة ثلاثية الأبعاد المفتوحة. بعد ذلك، قم بتصفية القيم الشاذة للإحداثيات الهوماتية باستخدام طريقة إزالة القيم الشاذة الإحصائية ثلاثية الأبعاد المفتوحة. بعد ذلك، حساب المسافات بين سحب نقاط HA وM1 عن طريق تحديد نقاط HA التي تبعد أكثر من 20 بكسل عن M1 كنقاط شاذة وحفظ الإحداثيات المتبقية في ملف نصي مخرج.

قم بدمج جميع الجسيمات واحفظها كملفات نجمة باستخدام ملف النجوم pts2. ال IPYNB. باستخدام WarpTools، استخرج الجسيمات التي تثني عامل الرقم أربعة وقم بإجراء متوسط التصوير الفرعي الأولي بمقدار RELION ناقص أربعة باستخدام الكود. حول ملف warp star إلى صيغة RELION 4.

ثم تولد مرجعا أوليا باستخدام RELION refine MPI على مجموعة فرعية من الجسيمات. قم بإجراء تحسين تلقائي ثلاثي الأبعاد على التصوير الفرعي باستخدام تقنية RELION refine MPI. عند التقارب، كرر التنقيح التلقائي مع إزاحة ترجمة تايتان إلى ثمانية وخطوة إلى اثنين.

استخدم التصنيف ثنائي الأبعاد للتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها باستخدام تصحيح RELION. أنشئ ملفات نجمة مع فئات جيدة باستخدام الكود، ثم ادمج ملفات النجوم الفردية. كشفت التصوير المصور عن فيرويونات متعددة الأشكال بأشكال تتراوح بين الكروية والأشكال الممدودة.

وصل المتوسط النهائي للتصوير الفرعي إلى دقة عالمية تبلغ 6.0 أنغستروم، مع دقة محلية تتراوح بين خمسة إلى سبعة أنغستروم. تم حل حلزونات ألفا وأوراق بيتا في إعادة بناء الهيدروليبيك النهائية، مما دعم الجودة الهيكلية للخريطة المحسنة. تم التعرف على مواقع الجليكوزيل في أربعة مواقع على رأس وساق الهيدروماترون، مما أكد رؤية كثافة الجليكان في إعادة البناء النهائية.